Développement de lignées cellulaires stables pour la production de vaccins

Flux de travail type des lignées cellulaires

Le développement de lignées cellulaires est le processus consistant à établir une population de cellules dérivée du clonage qui a été génétiquement conçue afin d’exprimer un phénotype souhaité (comme la production de grandes quantités de protéine recombinante) pendant une période définie. Les cellules uniques prolifèrent afin de former des colonies pouvant alors être évaluées afin de déterminer la caractéristique souhaitable.

Étape 1 : Transfection stable

Le processus de développement de lignées cellulaires commence par l’introduction d’ADN étranger (codant pour la protéine recombinante d’intérêt) dans une cellule hôte, processus connu sous le nom de transfection. Après la transfection, les cellules commencent à exprimer la protéine pendant une période transitoire (généralement moins d’une semaine) avant d’arrêter totalement la production. Toutefois, une petite sous-population conserve sa capacité à exprimer la protéine recombinante pendant de longues périodes en raison de l’intégration de l’ADN étranger dans son génome. Il s’agit de cellules transfectées de façon stable, sélectionnées pour passer à l’étape suivante.

Étape 2 : Enrichissement du pool

L’ADN étranger codant pour la protéine d’intérêt inclut souvent un marqueur sélectionnable supplémentaire pouvant être utilisé pour séparer les cellules transfectées de façon stable des cellules non transfectées. Par exemple, la protéine fluorescente verte (GFP) est souvent ajoutée à l’ADN étranger de façon à ce que les cellules transfectées deviennent fluorescentes et puissent être différenciées des cellules non transfectées qui ne sont pas fluorescentes. Il existe une forte corrélation entre le niveau d’expression de la protéine recombinante et le marqueur GFP inclus dans l’ADN étranger, ce qui vous permet d’utiliser l’intensité de la fluorescence des GFP pour identifier et enrichir leurs pools de cellules pour la forte expression des protéines.
 

Étape 3 : Isolement de cellules uniques

Le procédé de transfection stable, qu’il soit ciblé ou aléatoire, génèrera une population de cellules avec une expression hétérogène des protéines. Par conséquent, les cellules uniques doivent être isolées et clonées afin de garantir que la population de cellules est génétiquement identique, ce qui réduit significativement l’hétérogénéité de l’expression. L’isolement de cellules uniques est le procédé de séparation de cellules vivantes individuelles d'un bloc solide de tissu ou d'une suspension de cellules en vue d’une analyse ultérieure.
 

Étape 4 : Vérification de la monoclonalité et croissance cellulaire

Le clonage des cellules uniques est une étape extrêmement critique du processus de développement des lignées cellulaires. Il est important de vérifier que les cellules uniques sont correctement isolées les unes des autres dans une microplaque. Ceci est souvent documenté à l’aide d’un imageur cellulaire. La croissance des cellules est généralement surveillée après l’étape de clonage afin de s’assurer que leurs propriétés de croissance n’ont pas significativement changé. Cela inclut le processus de suivi de la progression d’une cellule unique en une colonie de cellules. 
 

Étape 5 : Titre et criblage CQA

Il s’agit d’un test détectant la quantité de protéine recombinante ou d’anticorps produite à partir de la lignée cellulaire dérivée du clonage.