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Essai Transfluor

Détecte l'activité du composé par rapport aux cibles RCPG connues et/ou orphelines dans un environnement de criblage à haut contenu d'information

L'essai Transfluor® est un essai de fluorescence cellulaire utilisé pour cribler les ligands des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) et les autres médicaments potentiels qui régulent les RCPG en désactivant ou en désensibilisant une voie commune. En fixant un marqueur fluorescent à la bêta-arrestine, la localisation du complexe récepteur-arrestine peut être analysé durant l'activation du récepteur. La désensibilisation ne se produisant qu'avec un récepteur activé, la surveillance de la translocation de la bêta-arrestine et du recyclage du récepteur suivant offre une méthode de détection de l'activation des RCPG.

L'étude de ce mécanisme permet aux chercheurs d'identifier l'impact des ligands RCPG sur différents processus physiologiques, notamment le comportement, l'humeur, l'inflammation, le système nerveux et les réponses olfactives. De plus, les chercheurs peuvent accroître leurs connaissances sur les complexités de la dégradation et du recyclage des récepteurs pour une cible donnée.

Caractéristiques

  • Validé avec plus de 100 RCPG, le test Transfluor vous permet de travailler sur toutes les classes de RCPG (Classe I, II, III), quelles que soient les protéines G qui interagissent (Gs, Gi/o et Gq/11).
  • La mesure unique est compatible avec tous les sous-types de RCPG, y compris Gi, Gs, Go, Gq, éliminant la nécessité de tests RCPG multiples.
  • L'absence d'étiquetage ou de marquage des RCPG évite la biologie moléculaire personnalisée susceptible d'altérer la réponse de votre cible.
  • Le format universel ne nécessite aucune connaissance préalable des protéines G interagissant, permettant le criblage des RCPG orphelins.
  • La technologie basée sur la GFP ne nécessite aucun substrat supplémentaire pour surveiller la translocation de la bêta-arrestine.
  • Le module d'application MetaXpress® permet d'automatiser l'analyse des mouvements de la bêta-arrestine dans la membrane cellulaire (puits) et les vésicules d’endocytose.
  • Le test de translocation indépendante du ligand (LITe™) est un test indépendant de l'agoniste utilisé pour vérifier la translocation de la bêta-arrestine-GFP dans les RCPG orphelins.

Avec la technologie Transfluor, l'arrestine-GFP est dispersée à travers le cytosol dans les cellules non stimulées. Lors de la liaison du ligand au RCPG, l'arrestine-GFP est rapidement transloquée du cytosol vers la membrane cellulaire, puis dans les puits revêtus de clathrine au niveau de la membrane. Le récepteur est alors internalisé dans les vésicules d’endocytose avant d'être retraité et de retourner vers la membrane cellulaire. Les puits et vésicules peuvent être imagés et quantifiés à l'aide d'appareils d'analyse et d'imagerie disponibles dans le commerce, tels que le système ImageXpress® Micro ou ImageXpress® Ultra, formant la base d'un test universel haut contenu et haut débit pour tous les RCPG (connus et orphelins).

 

Essai RCPG orphelin

 

Contrairement aux méthodes actuelles de criblage des RCPG, la technologie Transfluor est basée sur le mécanisme d'interruption du signal RCPG, connu sous le nom de désensibilisation du récepteur. Ce mécanisme est commun à pratiquement tous les RCPG et est activé par la liaison au ligand. La technologie Transfluor ne nécessite aucune connaissance préalable de la protéine G interagissant. Cette caractéristique importante de la technologie Transfluor la rend idéale pour le criblage des RCPG orphelins (oGPCR).

Une technique exclusive permettant de valider les criblages de RCPG orphelins, appelée LITe™ (translocation indépendante du ligand), est un essai indépendant de l'agoniste utilisé pour vérifier la translocation de la ß arrestine-GFP dans les RCPG orphelins.

Translocation indépendante du ligand

 

Références Transfluor

 

Garippa RJ, Hoffman AF, Gradl G, Kirsch A.
Microscopie confocale à haut débit pour tests RCPG de translocation de la bêta-arrestine-GFP à l'aide d'un système Opera d'Evotec.
Methods Enzymol. 2006 ; 414 : 99-120.

Hudson CC, Oakley RH, Sjaastad MD, Loomis CR.
Criblage à haut contenu d'information de récepteurs couplés aux protéines G connus par translocation de l'arrestine.
Methods Enzymol. 2006 ; 414 : 63-78.

Oakley RH, Hudson CC, Sjaastad MD, Loomis CR.
Le test de translocation indépendante du ligand : une technologie opérationnelle pour le criblage des récepteurs couplés aux protéines G par recrutement de l'arrestine.
Methods Enzymol. 2006 ; 414 : 50-63.

Haasen D, Wolff M, Valler MJ, Heilker R.
Comparaison de la redistribution de la bêta-arrestine associée à la désensibilisation du récepteur couplé à la protéine G à l'aide de l'imagerie confocale et non confocale.
Comb Chem High Throughput Screen. Janv. 2006 ; 9(1) : 37-47.

Ghosh RN, DeBiasio R, Hudson CC, Ramer ER, Cowan CL, Oakley RH.
Criblage cellulaire quantitatif à haut contenu d'information pour les agonistes des récepteurs de la vasopressine à l'aide de la technologie Transfluor.
J Biomol Screen. Août 2005 ; 10(5) : 476-84.

Ozawa K, Hudson CC, Wille KR, Karaki S, Oakley RH.
Développement et validation d'algorithmes pour la mesure de l'activation des récepteurs couplés à la protéine G dans les cellules à l'aide de la plate-forme de cytomètre d'imagerie LSC.
Cytometry A. Mai 2005 ; 65(1) : 69-76.

Oakley RH, Hudson CC, Cruickshank RD, Meyers DM, Payne RE Jr, Rhem SM, Loomis CR.
La distribution cellulaire des arrestines marquées par fluorescence offre un test robuste, sensible et universel pour le criblage des récepteurs couplés aux protéines G.
Assay Drug Dev Technol. Nov 2002 ; 1(1 Pt 1) : 21-30.

Cette technologie brevetée, de l'université Duke, utilise des lignées cellulaires génétiquement conçues pour exprimer la bêta-arrestine marquée et les RCPG d'intérêt. Elle peut être utilisée pour cribler les ligands naturels ou synthétiques, y compris les agonistes ou les antagonistes. Le test Transfluor ne nécessite aucune connaissance préalable de la protéine G interagissant, le rendant parfaitement adapté au criblage des RCPG orphelins.

Test Transfluor imagé avec Imagexpress.

Test Transfluor imagé avec Discovery-1.
Figure 1. Cellules exprimant la ß2AR stimulées avec de l'isoprotérénol. À gauche : contrôle, au centre : puits, à droite : vésicules. En haut : Essai Transfluor imagé avec ImageXpress. En bas : Essai Transfluor imagé avec Discovery-1.

 

Puits d'isoprotérénol

Vésicules d'isoprotérénol
Figure 2. Segmentation et analyse exécutées à l'aide du module d'application de Cycle RCPG pour MetaXpress. Analyse de dose-réponse à l'isoprotérénol. En haut : puits, en bas : vésicules. Les barres d'erreur affichent l'erreur standard.

 

Liste partielle des RCPG

 

La Technologie Transfluor permet de surveiller l'activité des récepteurs en détectant le mouvement de la bêta-arrestine-GFP dans la cellule. Une liste partielle des RCPG indiqués comme intervenant dans la translocation de la bêta-arrestine-GFP est affichée ci-dessous.

Gs

Gi/o

Gq/11

  • Adénosine A2a
  • Adénosine A2b
  • ß1-adrénergique
  • ß2-adrénergique
  • Facteur de libération de la corticotrophine CRF1
  • Dopamine D1
  • Dopamine D5
  • Hormone de stimulation folliculaire FSH
  • Glucagon
  • Hormone lutéinisante LH
  • Hormone parathyroïdienne PTH1
  • Prostaglandine E2
  • Prostaglandine E4
  • Sécrétine
  • Peptide intestinal vasoactif VIP1
  • Vasopressine V2
  • alpha 2a-adrénergique
  • alpha 2b-adrénergique
  • alpha 2c-adrénergique
  • Adénosine A1
  • Adénosine A3
  • Apeline
  • Anaphylatoxine C5a
  • Chimiokine CCR5
  • Chimiokine CXCR1
  • Chimiokine CXCR2
  • Chimiokine CXCR4
  • Dopamine D2
  • Dopamine D3
  • Dopamine D4
  • Gène de diff. endothéliale Edg1
  • Gène de diff. endothéliale Edg2
  • Gène de diff. endothéliale Edg3
  • Gène de diff. endothéliale Edg5
  • Hydroxytryptamine 5HT1A
  • delta-opioïde
  • mu-opioïde
  • Hormone de conc. de la mélanine MCH1
  • Acétylcholine muscarinique M2Ach
  • Prostaglandine E3
  • Peptide N-formyl
  • Neuropeptide FF
  • Somatostatine
  • alpha 1b-adrénergique
  • Angiotensine II AT1A
  • Cholécystokinine CCK-A
  • Cholécystokinine CCK-B
  • Cytomégalovirus US28
  • Endothéline ETA
  • Hormone de libération des gonadotrophines GnRH (type 2)
  • Hydroxytryptamine 5HT2A
  • Hydroxytryptamine 5HT2C
  • Acétylcholine muscarinique m1ACh
  • Glutamate métabotropique mGluR1
  • Neurokinine NK1
  • Neurokinine NK3
  • Neurotensine NT1
  • Orexine-1
  • Oxytocine
  • PAR2 activé par la protéinase
  • Facteur d'activation plaquettaire
  • Hormone de libération de la thyréostimuline TRHR-1
  • Hormone de libération de la thyréostimuline TRHR-2

Autre liste de récepteurs

  • 12 RCPG de drosophile
  • Récepteur Frizzled Fz4
  • Facteur-ß de croissance transformant TßRIII

Le test Transfluor est compatible avec les systèmes suivants :

Pour plus d'informations, consultez le tableau de compatibilité des kits de test et instruments.

L'achat de ces produits Transfluor nécessite l'exécution préalable de l'accord de licence Transfluor et de la licence BioImage. En cas de commande d'une lignée cellulaire ou d'un plasmide GFP, une licence Prolume est également requise pour l'achat.

Nom du produit Numéro de référence

Kit d'évaluation Transfluor® (usage non commercial)
R8177

Kit d'évaluation Transfluor® (usage commercial)
R8178
Lignées cellulaires parentales U2OS (G418) rat b-arrestine 2-RrGFP TF-U2OS-rBA2GFP

 

Kit d'évaluation Transfluor

 

Le kit d'évaluation Transfluor permet d'utiliser la technologie pour une période d'évaluation unique limitée de six mois. Le kit fournit tous les outils nécessaires à l'évaluation de la technologie avec les propres instruments et RCPG de l'utilisateur. Cela permet à l'utilisateur de se familiariser avec la technologie, avant de passer à une option de licence différenciée pour répondre aux besoins spécifiques du client.

 

Composants du kit d'évaluation Transfluor

 

  • Cellules U-2 OS β-arrestine2-GFP (lignée cellulaire parentale, pour aider la détermination de la réponse du Transfluor au choix de RCPG de l'utilisateur final)
  • Plaque de démonstration Transfluor (plaque de qualité imagerie pour aider à la validation de l'instrument et à l'acquisition et à l'analyse de l'image)
  • Licence d'étiquette limitée
  • Fiche produit du kit d'évaluation Transfluor
  • Fiche produit des cellules U-2 OS β-arrestine2-GFP
  • Protocole de démarrage rapide Transfluor

Guide d'utilisation Transfluor (fourni avec les protocoles et consignes de dépannage)

Veuillez contacter votre représentant local pour obtenir des renseignements détaillés concernant ce kit.

Options de licence différenciées

L'utilisation de la technologie Transfluor nécessite l'achat de la licence d'utilisation de cette technologie auprès de Molecular Devices. Cette licence est renouvelable chaque année. Une structure de licence évolutive est disponible depuis la recherche jusqu'au criblage à haut débit, comprenant les exemples suivants :

  • Licence de site de recherche avec kit Transfluor
  • Licence globale de recherche avec kit Transfluor
  • Licence de site de criblage avec Transfluor
  • Licence de site de recherche et de criblage avec kit Transfluor

Deux licences tierces supplémentaires sont requises pour utiliser le test Transfluor : une licence GFP (Molecular Devices recommande la licence GFP Renilla reniformis (Rr) de Prolume) et la licence de redistribution de la fluorescence de BioImage. Les conditions sont les suivantes :

  • La licence Prolume est renouvelable chaque année pour une somme minime.
  • La licence BioImage est payable en une seule fois.
  • Les licences Prolume et BioImage offrent une couverture internationale.

Afin de simplifier vos opérations, ces licences sont disponibles directement auprès de Molecular Devices. De même, vous pouvez également les obtenir directement auprès de Prolume et BioImage.

Veuillez contacter votre représentant local pour obtenir des renseignements détaillés concernant ces licences. Outre la licence Transfluor, Molecular Devices fournit également une lignée cellulaire GFP bêta-arrestine de démarrage, transfectée de manière stable, et les plasmides adéquats.