Absorbance

Comment fonctionne la détection de l’absorbance ?

Les spectrophotomètres et les lecteurs de microplaques en absorbance mesurent la quantité de lumière absorbée par un échantillon. Les lecteurs de microplaques capables de détecter la lumière dans la gamme des ultraviolets (UV) peuvent être utilisés pour déterminer la concentration des acides nucléiques (ADN et ARN) ou des protéines directement, sans avoir à marquer les échantillons. La lumière avec une certaine longueur d'onde, qui dépend de la substance mesurée, traverse un échantillon, et un détecteur de l’autre côté du puits de la microplaque mesure la quantité de la lumière d’origine ayant été absorbée par l’échantillon dans le puits.

Dans quoi est mesurée l’absorbance ?

L’absorbance est mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre ou d'un lecteur de microplaques, qui est un instrument qui émet une lumière d’une longueur d'onde spécifiée à travers un échantillon et qui mesure la quantité de lumière absorbée par l’échantillon.

Spectrophotomètre vs. lecteur de microplaques

Un spectrophotomètre standard mesure l’absorbance d’un échantillon à la fois, généralement placé dans une cuvette à travers laquelle de la lumière est envoyée horizontalement. Un lecteur de microplaques en absorbance permet un débit plus élevé et peut mesurer l’absorbance des échantillons dans des microplaques, généralement de 96 puits, voire 384 puits, en envoyant de la lumière verticalement à travers chaque puits.

En savoir plus sur les lecteurs de microplaques en absorbance  

Comment exécuter un protocole ELISA d’absorbance ?

Un test ELISA, ou dosage d’immunoabsorption enzymatique, est une méthode utilisée pour détecter de façon quantitative un antigène dans un échantillon. La plupart des tests ELISA sont exécutés dans des microplaques, le fond des puits des microplaques servant de surface solide à laquelle un antigène d’intérêt se fixe, soit directement, soit via un anticorps. Un conjugué enzymatique, qui réagit avec le substrat afin de produire une solution colorée, est utilisé pour détecter l’antigène. Un laveur de microplaques est utilisé pour éliminer les substances non fixées et non spécifiques se trouvant dans les puits, et un lecteur de microplaques ELISA en absorbance détecte la variation de couleur produite lorsque l’antigène cible est présent.

En savoir plus sur les tests ELISA  

Comment la lumière parasite affecte-t-elle le résultat de densité optique (DO) ?

Lumière parasite est un terme général pour désigner une lumière indésirable qui atteint le détecteur d’un instrument. L’effet de la lumière parasite sur un résultat d’absorbance est souvent une DO étonnamment basse ; l’absorbance mesurée est plus faible que l’absorbance réelle de l’échantillon. L’impact est généralement sur la linéarité et est maximal lorsque l’on mesure des DO supérieures à 2,0-2,5. L’utilisateur ne peut pas corriger la lumière parasite, et généralement, elle n’est pas provoquée par une erreur de l’utilisateur. Les causes possibles comprennent des composants optiques, tels que des filtres d’excitation, dégradés. Les spectrophotomètres et les lecteurs de microplaques en absorbance intègrent généralement des fonctions visant à minimiser la lumière parasite.

• Mesures de densité optique automatiquement corrigées jusqu'à une longueur de trajet optique de 1 cm avec la technologie PathCheck

Viabilité cellulaire, Prolifération cellulaire, Tests de cytotoxicité (MTT, XTT, MTS)

Des tests colorimétriques utilisant des sels de tétrazolium, tels que MTT, XTT et MTS, peuvent être utilisés pour mesurer la cytotoxicité et la prolifération cellulaire. Par exemple, le test MTT dépend de la diminution du MTT par les enzymes présentes dans les cellules viables afin de former un produit formazan bleu pouvant être quantifié en mesurant l’absorbance. Le choix du test peut se baser sur le flux de travail souhaité et le temps requis.

Lire la note d’application pour en savoir plus sur certaines de ces méthodes :

• Évaluez la viabilité et la prolifération cellulaires avec des lectures colorimétriques

Tests ELISA / Tests immunologiques (Quantification des antigènes, anticorps, cytokines…)

Les dosages d’immunoabsorption enzymatique (ELISA) sont utilisés pour mesurer la quantité d’une protéine spécifique, généralement dans une microplaque, et les résultats sont le plus souvent détectés par absorbance dans la gamme de longueurs d'onde visibles.

Voici plusieurs notes d’application sur les tests ELISA qui peuvent se révéler utiles :

• Quantifier les concentrations d’interleukine-8 sur le lecteur de microplaques SpectraMax ABS Plus avec le kit ELISA SimpleStep
• Détection haut débit de mélamine avec les tests AgraQuant Melamine de Romer Labs et les lecteurs d'absorbance Molecular Devices
• Quantification du gluten dans la bière avec une méthode ELISA approuvée par ASBC

Quantification de l’ADN/ARN

L’absorbance d’un échantillon d’ADN mesurée à 260 nm sur un spectrophotomètre ou un lecteur de microplaques peut être utilisée pour calculer sa concentration. Quantification de l’absorbance pour des travaux sur l’ADN sur des échantillons compris entre 0,25 µg/ml et 125 µg/ml environ en format microplaque.

Découvrez comment l’absorbance est mesurée sur nos lecteurs de microplaques en absorbance grâce à nos notes d’application :

• Mesures d'absorbance ADN et ARN avec les lecteurs de microplaques SpectraMax
• Détection de protéines et d’ADN à haut débit et faible volume sur le lecteur de microplaques SpectraMax ABS Plus

Témoignage d’un client : Tests avec lecteurs de microplaques en absorbance, synthétiseurs d’ADN/ARN

OligoMaker ApS utilise le lecteur SpectraMax 190 pour tester ses synthétiseurs d’ADN/ARN

« Nous utilisons le SpectraMax 190 pour tester les synthétiseurs d’ADN/ARN que nous concevons. Nous devons quantifier les amorces et les sondes pour déterminer la quantité d’ADN/ARN synthétisée par le synthétiseur d’ADN/ARN. »

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Tests d'endotoxines

La surveillance des contaminants constitue une étape critique pendant le processus de production dans les industries des produits pharmaceutique et des dispositifs médicaux. Un contaminant fréquent, l’endotoxine, peut causer de la fièvre, une inflammation, des maux de tête, des nausées, voire même le décès. Heureusement, les endotoxines peuvent être facilement surveillées avec des tests turbidimétriques, colorimétriques ou fluorométriques.

Ces notes d’application décrivent les différents types de dosage des endotoxines :

• Surveillez le taux d’endotoxines grâce au lecteur de microplaques SpectraMax ABS Plus
• Tests d'endotoxine sur microplaque dans les environnements BPL/BPF avec un test colorimétrique
• Détecter les endotoxines avec le test Facteur C recombinant PyroGene

Cinétique enzymatique, croissance bactérienne/microbienne

De nombreuses expériences biologiques nécessitent le suivi de la croissance bactérienne ou la mesure des changements enzymatiques pendant une période prolongée (des heures, des jours ou même des semaines).

Voici quelques notes d’application montrant comment paramétrer les tests cinétiques afin de mesurer la croissance bactérienne avec nos instruments et logiciels :

• Analyse cinétique avancée d’un test de croissance bactérienne
• Mesures de la cinétique multi-tâches des effets de l'IPTG sur l'expression des protéines et la croissance cellulaire
• Mesure de la croissance cellulaire à long terme en utilisant une lecture cinétique discontinue

Témoignage d’un client : Lecteurs de microplaques en absorbance utilisés dans la recherche de biofilm

L’Université Catholique de Louvain utilise nos lecteurs d’absorbance et multimode SpectraMax pour la lutte contre les biofilms

Selon Wafi Siala, un autre avantage important de l’UCL est « le vaste choix parmi les différentes tailles de microplaques, allant de 6 à 384 puits, offert par le SpectraMax série M ».

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Applications microvolumiques

La quantification de nombreux types d’échantillon est possible grâce à des mesures d'absorbance dans une cuvette ou une microplaque. Toutefois, lorsque la substance est rare ou que les échantillons sont précieux, la quantification de très faibles volumes d’échantillon est requise. Il existe des instruments et accessoires permettant la quantification dans des volumes aussi petits que 2 µl, voire même 0,5 µl.

En savoir plus sur nos instruments et techniques micro-volume :

• Quantification directe des protéines avec la microplaque à micro-volume SpectraDrop
• Optimisation des performances de la microplaque microvolume SpectraDrop pour la quantification de l'ADN
• Quantification et analyse d’acides nucléiques grâce au spectrophotomètre QuickDrop

Mesures de la densité optique en utilisant la technologie PathCheck

Les spectrophotomètres UV-visible et les lecteurs de microplaques sont totalement différents en ce qui concerne la géométrie de leurs faisceaux. Dans les spectrophotomètres, les échantillons sont lus dans des cuvettes ou tubes avec une trajectoire lumineuse horizontale de 1 cm, ce qui simplifie les tests se basant sur les coefficients d’extinction. Dans les lecteurs de microplaques, le faisceau lumineux vertical entraîne un trajet optique qui dépend du volume de liquide dans chaque puits. Ce problème a été contré avec la technologie PathCheck® de Molecular Devices, qui corrige automatiquement les mesures de densité optique (DO) à un trajet optique de 1 cm.

Ces notes d'application abordent les principes et utilisations de la technologie PathCheck :

• Mesures de densité optique automatiquement corrigées jusqu'à une longueur de trajet optique de 1 cm avec la technologie PathCheck
• Dosage des composés phénoliques dans le vin rouge avec le lecteur de microplaques SpectraMax Plus 384
• Mesures d'absorbance ADN et ARN avec les lecteurs de microplaques SpectraMax

Quantification des protéines (tests BCA, Bradford, Lowry)

La concentration de protéines peut être mesurée directement, par absorbance à 280 nm dans un spectrophotomètre UV-visible, ou indirectement, en utilisant des méthodes colorimétriques telles que les tests BCA ou Bradford.

Voici quelques notes d'application sur la quantification des protéines qui peuvent se révéler intéressantes :

• Mesurer les protéines totales dans des lysats cellulaires avec le lecteur de microplaques SpectraMax ABS Plus
• Quantification des protéines avec le lecteur de microplaques EMax Plus
• Quantification directe des protéines avec la microplaque à micro-volume SpectraDrop
• Intégrez la quantification des protéines basée sur BCA au lecteur SpectraMax iD5