Fluorescence

Fluoromètre vs spectrofluoromètre vs lecteur de microplaques à fluorescence

Il existe de nombreux termes pour faire référence aux instruments utilisés pour mesurer la fluorescence d’un échantillon : fluoromètre, spectrofluoromètre, spectrophotomètre à fluorescence, spectromètre à fluorescence, fluorimètre, etc. 

En général, ils utilisent une source de lumière pour exciter l’échantillon à une certaine longueur d'onde et mesurent la fluorescence émise à une seconde longueur d'onde. L’échantillon peut être conservé dans plusieurs formats, notamment cuvettes, capillaires et boîtes de Petri. « Lecteur de microplaques en fluorescence » fait référence à un instrument pouvant mesurer la fluorescence d’échantillons dans une microplaque, le plus souvent une microplaque à 96 ou 384 puits. Les microplaques permettent un débit plus élevé et sont utiles pour le criblage ou d’autres applications dans lesquelles de nombreux échantillons doivent être analysés.

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Qu’est-ce qu’un spectrofluoromètre à double monochromateur ?

Certains lecteurs de microplaques en fluorescence utilisent des monochromateurs doubles plutôt que des filtres pour sélectionner la longueur d'onde de la lumière qui excite l’échantillon, ainsi que la longueur d'onde qui est émise par l’échantillon. Les monochromateurs utilisent un réseau de diffraction pour séparer spatialement les couleurs de la lumière et peuvent sélectionner un grand nombre de longueurs d'onde sans avoir à installer un filtre distinct pour chaque longueur d'onde requise par une application.

Notre spectrofluoromètre à double monochromateur SpectraMax Gemini utilise deux monochromateurs de balayage pour la sélection de longueurs d'onde d’excitation et d’émission optimales.

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Dosages du calcium (GPCR)

La signalisation cellulaire grâce aux récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) peut être évaluée en surveillant les effecteurs en aval comme l'AMP cyclique (AMPc) ou le calcium. Le flux de calcium en réponse à l’activation des récepteurs couplés aux protéines G_q est couramment surveillé en temps réel dans les cellules vivantes en utilisant des colorants sensibles au calcium sur un lecteur de microplaques en fluorescence.

Voici quelques notes d'application sur les tests calcium (GPCR) qui peuvent se révéler utiles :

• Étude de l'activation du récepteur couplé aux protéines G_q sur le lecteur SpectraMax i3x avec un module d'injecteur*
• Optimisation d'un test sur le récepteur muscarinique M3 en utilisant des cellules CHO congelées sur le lecteur FlexStation 3
• Signalisation calcique avec les kits de test FLIPR Calcium 6 et 6-QF sur le lecteur FlexStation 3

Tests cAMP (GPCR)

La surveillance des taux de cAMP, un second messager produit en réponse à l’activation de l’adénylate cyclase, est l’une des façons les plus courantes de cribler les agonistes et antagonistes des récepteurs couplés aux protéines Gi/Gs. Les taux de cAMP peuvent être surveillés en utilisant des molécules fluorescentes qui se fixent au cAMP et sont détectées par un lecteur de microplaques en fluorescence.

Voici quelques notes d'application sur les tests cAMP (GPCR) qui peuvent se révéler utiles :

• Réaliser une solution de flux de travail cAMP en utilisant le Kit de test fluorescent CatchPoint cAMP
• Test HTRF cAMP HiRange sur les lecteurs de microplaques multimode SpectraMax

Tests apoptose Caspase-3

L’apoptose est un programme cellulaire très régulé qui entraîne la mort des cellules dans des processus normaux tels que le développement embryonnaire, ainsi que dans des processus pathologiques, dont ceux du cancer et des maladies neurodégénératives. Les tests d’apoptose peuvent être réalisés avec un grand nombre de systèmes d’imagerie ou de systèmes de détection de lecteur de microplaques et fournissent des informations précieuses sur les mécanismes de mort cellulaire normaux et associés à des affections.

En savoir plus sur le test homogène en une seule étape Caspase-3, spécialement conçu pour les lecteurs de microplaques :

• Kit de test EarlyTox Caspase-3/7 R110 sur lecteurs de microplaques à fluorescence SpectraMax

Tests de prolifération cellulaire

La quantification de la prolifération cellulaire par fluorescence permet de surveiller facilement les effets des médicaments et autres traitements expérimentaux sur la croissance cellulaire.

Cette note d'application décrit deux méthodes de test de prolifération cellulaire. Dans la première méthode, la prolifération cellulaire est quantifiée à l’aide d’une courbe d’étalonnage cellulaire. Dans la seconde, la prolifération cellulaire est quantifiée en utilisant des échantillons cellulaires traités par RNase et une courbe d’étalonnage de l’ADN.

• Mesure de la prolifération cellulaire en utilisant le test de prolifération cellulaire CyQUANT avec les lecteurs de microplaques SpectraMax

Tests de cytotoxicité

Le développement de tests in vitro prédictifs adaptés aux tests d’efficacité et de sécurité est particulièrement intéressant pour améliorer le processus de développement des médicaments et réduire l’attrition des médicaments. L’utilisation des cellules souches comme outils pour le criblage des composés au début du développement des médicaments suscite beaucoup d'intérêt.

Sur cette affiche scientifique, nous présentons les résultats obtenus avec l’un de nos lecteurs de microplaques multimode pour l’évaluation de la toxicité de divers composés en utilisant des modèles cellulaires dérivés de cellules souches à haut débit :

• Tests cellulaires à haut débit pour l'évaluation de la toxicité avec le lecteur de microplaques SpectraMax^® Paradigm

Test de cardiotoxicité EarlyTox

Les cardiomyocytes humains dérivés de cellules souches ont des caractéristiques phénotypiques et des profils électrophysiologiques similaires à ceux des cellules cardiaques humaines natives. Les cardiomyocytes en culture peuvent former un syncytium qui bat, se comportant comme les cardiomyocytes natifs. L’oscillation du taux de calcium intracellulaire survenant avec les contractions synchronisées des cellules peut être surveillée en utilisant un colorant sensible au calcium, et les modifications du modèle d’oscillation induites par le traitement peuvent être surveillées avec les changements du signal fluorescent dans le temps.

Voici une note d'application qui peut se révéler intéressante :

• Tests à paramètres multiples pour les cardiomyocytes sur une seule plateforme

Kits de test de viabilité cellulaire EarlyTox

Les tests de viabilité cellulaire sont essentiels dans de très nombreux domaines de recherche, allant de l’étude des mécanismes de la mort cellulaire au développement de nouveaux médicaments destinés à inhiber l’apoptose pathologique. Le lecteur de microplaques à fluorescence est l'une des technologies de détection privilégiées pour la viabilité cellulaire.

Voici quelques applications qui peuvent se révéler intéressantes :

• Détermination de la santé des cellules par des tests de viabilité cellulaire utilisant le lecteur SpectraMax iD3
• Kit de test EarlyTox Live/Dead sur lecteurs de microplaques à fluorescence SpectraMax
• Kit de test EarlyTox Caspase-3/7 R110 sur lecteurs de microplaques à fluorescence SpectraMax
• Kit de test EarlyTox Gluthatione sur lecteurs de microplaques à fluorescence SpectraMax

Quantification des protéines par fluorescence

Les protéines dans les cellules eucaryotes existent dans un état dynamique, dans un équilibre hautement régulé entre la synthèse et la dégradation. Même si l’on comprend bien la synthèse des protéines après des décennies d’étude, les connaissances sur la dégradation des protéines ont vraiment progressé au cours de ces vingt dernières années.

En savoir plus sur la protéine fluorescente dans notre note d'application :

• Mesure de l’inhibition protéosomique dans des cellules vivantes sur les lecteurs de microplaques Analyst® GT, FLEXstation® et Gemini EM avec le capteur protéosomique BD Biosciences
• Utilisation du kit NanoOrange Protein avec les lecteurs de microplaques SpectraMax

Analyse des nanoparticules

La nanotechnologie, un domaine en plein essor, suscite l’intérêt de la communauté scientifique en raison de ses applications potentielles en recherche biomédicale.

Actuellement, il existe un nombre limité de techniques disponibles pour caractériser les nanoparticules et leurs interactions moléculaires. Ici, nous décrivons l’analyse de signature spectrale comme méthode de confirmation des interactions entre nanoparticules et molécules de surface.

• Analyse de signature spectrale de nanoparticules fonctionnalisées en surface

Flux de calcium neuronal

Le suivi des variations du taux de calcium intracellulaire est une technique extrêmement utile pour étudier les divers rôles joués par les ions calcium dans les neurones en fonctionnement. Une mesure directe du flux de calcium dynamique dans les réseaux neuronaux révèle la façon dont les neurones traitent les signaux depuis l’espace extracellulaire.

Cette note d'application démontre la faisabilité de la mesure du flux de calcium intracellulaire dans des neurones corticaux primaires de rat dans une microplaque fluorescente :

• Test de flux du calcium pour les études de neurotoxicité in vitro et le criblage de médicaments

Quantification des acides nucléiques

La quantification de l’ADN est une étape critique des méthodes de biologie moléculaire qui requiert une excellente précision et une grande fiabilité. Les méthodes actuelles doivent s'adapter à l’utilisation de volumes d’échantillon de plus en plus faibles pour des applications, telles que le séquençage nouvelle génération. En comparaison avec la quantification de l’ADN par spectrophotomètre, la méthode fluorométrique offre plusieurs avantages importants comme une augmentation significative de la sensibilité, une grande sélectivité pour l’ADN double brin (ADNdb) par rapport à l’ADN simple brin (ADNsb) ou l’ARN, et une tolérance accrue aux contaminants (protéines et glucides).

Voici quelques notes d'application sur la quantification des acides nucléiques qui peuvent se révéler intéressantes :

• Quantification d’échantillons d’ADN double brin à l’aide des kits de test d’ADNdb SpectraMax Quant
• Quantification sensible par fluorescence de l’ADN avec le kit de test Quant-iT PicoGreen dsDNA

Détection du tryptophane

La fluorescence intrinsèque des protéines est due aux acides aminés aromatiques tryptophane, tyrosine et phénylalanine. Le tryptophane domine l’émission des protéines et est le plus sensible à la polarité des solvants et à l’environnement local. L’analyse des variations de la fluorescence du tryptophane peut permettre d’obtenir des informations sur la dénaturation et la conformation des protéines.

Dans ces notes d’application, nous démontrons la performance des lecteurs de microplaques multimode SpectraMax® pour les tests mesurant la fluorescence intrinsèque du tryptophane.

• Mesure de la fluorescence intrinsèque du tryptophane sur le lecteur de microplaques SpectraMax iD3
• Détection du tryptophane intrinsèque avec la plateforme de microplaques multimode SpectraMax i3