Qu’est-ce que la fluorescence ?
La fluorescence est la propriété de certains atomes et molécules qui leur permet d’absorber la lumière à une longueur d'onde particulière (excitation : Ex) suivie d’une brève émission (Em) de lumière à une longueur d'onde plus longue (Figure 2). La distance entre les pics d’excitation et d’émission est appelée déplacement de Stokes (ou Stokes shift) et dépend du fluorophore (Figure 1).
La fluorescence implique une source de lumière externe pour exciter l’échantillon à une longueur d'onde particulière. Lorsque la molécule est excitée à la longueur d'onde appropriée, elle passe d’un état fondamental à un état excité. Lorsque la molécule retourne à l’état fondamental, de l’énergie est libérée sous forme de chaleur (perte d’énergie) et de lumière à une longueur d'onde plus longue différente d’énergie plus faible (Figure 3).

Figure 1

Figure 2

Figure 3
Comment fonctionne la détection de la fluorescence ?
Un lecteur de microplaques avec détection de l’intensité de la fluorescence (IF) utilise une source de lumière, généralement une lampe flash Xenon ou une LED, pour exciter un fluorophore (molécule fluorescente) à une longueur d'onde particulière. La longueur d'onde requise pour exciter l’échantillon peut être sélectionnée en utilisant un filtre d’une longueur d'onde spécifique ou un monochromateur réglé à la longueur d'onde requise.
Le fluorophore émet alors une lumière d’une longueur d'onde différente, sélectionnée par un second filtre ou monochromateur. La fluorescence émise est détectée par un tube photomultiplicateur (TPM), et l’intensité de la fluorescence de l’échantillon est exprimée en unités de fluorescence relative.
Présentation de la fluorescence
Définitions de la fluorescence
Citations de clients
Notre lecteur de microplaques SpectraMax Gemini a plus de 10 400 et permet le comptage
Applications de la fluorescence
- Dosages du calcium (GPCR)
- Tests cAMP (GPCR)
- Tests apoptose Caspase-3
- Tests de prolifération cellulaire
- Tests de cytotoxicité
- Test de cardiotoxicité EarlyTox
- Kits de test de viabilité cellulaire EarlyTox
- Quantification des protéines par fluorescence
- Analyse des nanoparticules
- Flux de calcium neuronal
- Quantification des acides nucléiques
- Détection du tryptophane
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Fluoromètre vs spectrofluoromètre vs lecteur de microplaques à fluorescence
Il existe de nombreux termes pour faire référence aux instruments utilisés pour mesurer la fluorescence d’un échantillon : fluoromètre, spectrofluoromètre, spectrophotomètre à fluorescence, spectromètre à fluorescence, fluorimètre, etc.
En général, ils utilisent une source de lumière pour exciter l’échantillon à une certaine longueur d'onde et mesurent la fluorescence émise à une seconde longueur d'onde. L’échantillon peut être conservé dans plusieurs formats, notamment cuvettes, capillaires et boîtes de Petri. « Lecteur de microplaques en fluorescence » fait référence à un instrument pouvant mesurer la fluorescence d’échantillons dans une microplaque, le plus souvent une microplaque à 96 ou 384 puits. Les microplaques permettent un débit plus élevé et sont utiles pour le criblage ou d’autres applications dans lesquelles de nombreux échantillons doivent être analysés.
Qu’est-ce qu’un spectrofluoromètre à double monochromateur ?
Certains lecteurs de microplaques en fluorescence utilisent des monochromateurs doubles plutôt que des filtres pour sélectionner la longueur d'onde de la lumière qui excite l’échantillon, ainsi que la longueur d'onde qui est émise par l’échantillon. Les monochromateurs utilisent un réseau de diffraction pour séparer spatialement les couleurs de la lumière et peuvent sélectionner un grand nombre de longueurs d'onde sans avoir à installer un filtre distinct pour chaque longueur d'onde requise par une application.
Notre spectrofluoromètre à double monochromateur SpectraMax Gemini utilise deux monochromateurs de balayage pour la sélection de longueurs d'onde d’excitation et d’émission optimales.
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Dosages du calcium (GPCR)
La signalisation cellulaire grâce aux récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) peut être évaluée en surveillant les effecteurs en aval comme l'AMP cyclique (AMPc) ou le calcium. Le flux de calcium en réponse à l’activation des récepteurs couplés aux protéines Gq est couramment surveillé en temps réel dans les cellules vivantes en utilisant des colorants sensibles au calcium sur un lecteur de microplaques en fluorescence.
Voici quelques notes d'application sur les tests calcium (GPCR) qui peuvent se révéler utiles :
- Étude de l'activation du récepteur couplé aux protéines Gq sur le lecteur SpectraMax i3x avec un module d'injecteur*
- Optimisation d'un test sur le récepteur muscarinique M3 en utilisant des cellules CHO congelées sur le lecteur FlexStation 3
- Signalisation calcique avec les kits de test FLIPR Calcium 6 et 6-QF sur le lecteur FlexStation 3
Tests cAMP (GPCR)
La surveillance des taux de cAMP, un second messager produit en réponse à l’activation de l’adénylate cyclase, est l’une des façons les plus courantes de cribler les agonistes et antagonistes des récepteurs couplés aux protéines Gi/Gs. Les taux de cAMP peuvent être surveillés en utilisant des molécules fluorescentes qui se fixent au cAMP et sont détectées par un lecteur de microplaques en fluorescence.
Voici quelques notes d'application sur les tests cAMP (GPCR) qui peuvent se révéler utiles :
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Tests apoptose Caspase-3
L’apoptose est un programme cellulaire très régulé qui entraîne la mort des cellules dans des processus normaux tels que le développement embryonnaire, ainsi que dans des processus pathologiques, dont ceux du cancer et des maladies neurodégénératives. Les tests d’apoptose peuvent être réalisés avec un grand nombre de systèmes d’imagerie ou de systèmes de détection de lecteur de microplaques et fournissent des informations précieuses sur les mécanismes de mort cellulaire normaux et associés à des affections.
En savoir plus sur le test homogène en une seule étape Caspase-3, spécialement conçu pour les lecteurs de microplaques :
Tests de prolifération cellulaire
La quantification de la prolifération cellulaire par fluorescence permet de surveiller facilement les effets des médicaments et autres traitements expérimentaux sur la croissance cellulaire.
Cette note d'application décrit deux méthodes de test de prolifération cellulaire. Dans la première méthode, la prolifération cellulaire est quantifiée à l’aide d’une courbe d’étalonnage cellulaire. Dans la seconde, la prolifération cellulaire est quantifiée en utilisant des échantillons cellulaires traités par RNase et une courbe d’étalonnage de l’ADN.
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Tests de cytotoxicité
Le développement de tests in vitro prédictifs adaptés aux tests d’efficacité et de sécurité est particulièrement intéressant pour améliorer le processus de développement des médicaments et réduire l’attrition des médicaments. L’utilisation des cellules souches comme outils pour le criblage des composés au début du développement des médicaments suscite beaucoup d'intérêt.
Sur cette affiche scientifique, nous présentons les résultats obtenus avec l’un de nos lecteurs de microplaques multimode pour l’évaluation de la toxicité de divers composés en utilisant des modèles cellulaires dérivés de cellules souches à haut débit :
Test de cardiotoxicité EarlyTox
Les cardiomyocytes humains dérivés de cellules souches ont des caractéristiques phénotypiques et des profils électrophysiologiques similaires à ceux des cellules cardiaques humaines natives. Les cardiomyocytes en culture peuvent former un syncytium qui bat, se comportant comme les cardiomyocytes natifs. L’oscillation du taux de calcium intracellulaire survenant avec les contractions synchronisées des cellules peut être surveillée en utilisant un colorant sensible au calcium, et les modifications du modèle d’oscillation induites par le traitement peuvent être surveillées avec les changements du signal fluorescent dans le temps.
Voici une note d'application qui peut se révéler intéressante :
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Kits de test de viabilité cellulaire EarlyTox
Les tests de viabilité cellulaire sont essentiels dans de très nombreux domaines de recherche, de l’étude des mécanismes de la mort cellulaire au développement de nouveaux médicaments destinés à inhiber l’apoptose pathologique.
Le lecteur de microplaques à fluorescence est l'une des technologies de détection privilégiées pour la viabilité cellulaire. Voici quelques applications qui peuvent se révéler intéressantes :
- Détermination de la santé des cellules par des tests de viabilité cellulaire utilisant le lecteur SpectraMax iD3
- Kit de test EarlyTox Live/Dead sur lecteurs de microplaques à fluorescence SpectraMax
- Kit de test EarlyTox Caspase-3/7 R110 sur lecteurs de microplaques à fluorescence SpectraMax
- Kit de test EarlyTox Gluthatione sur lecteurs de microplaques à fluorescence SpectraMax
Quantification des protéines par fluorescence
Les protéines dans les cellules eucaryotes existent dans un état dynamique, dans un équilibre hautement régulé entre la synthèse et la dégradation. Même si l’on comprend bien la synthèse des protéines après des décennies d’étude, les connaissances sur la dégradation des protéines ont vraiment progressé au cours de ces vingt dernières années.
En savoir plus sur la protéine fluorescente dans notre note d'application :
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Analyse des nanoparticules
La nanotechnologie, un domaine en plein essor, suscite l’intérêt de la communauté scientifique en raison de ses applications potentielles en recherche biomédicale.
Actuellement, il existe un nombre limité de techniques disponibles pour caractériser les nanoparticules et leurs interactions moléculaires. Ici, nous décrivons l’analyse de signature spectrale comme méthode de confirmation des interactions entre nanoparticules et molécules de surface.
Flux de calcium neuronal
Le suivi des variations du taux de calcium intracellulaire est une technique extrêmement utile pour étudier les divers rôles joués par les ions calcium dans les neurones qui fonctionnent. Une mesure directe du flux de calcium dynamique dans les réseaux neuronaux révèle la façon dont les neurones traitent les signaux depuis l’espace extracellulaire.
Cette note d'application démontre la faisabilité de la mesure du flux de calcium intracellulaire dans des neurones corticaux primaires de rat dans une microplaque fluorescente :
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Quantification des acides nucléiques
La quantification de l’ADN est une étape critique des méthodes de biologie moléculaire qui requiert une excellente précision et une grande fiabilité. Les méthodes actuelles doivent s'adapter à l’utilisation de volumes d’échantillon de plus en plus faibles pour des applications, telles que le séquençage nouvelle génération. En comparaison avec la quantification de l’ADN par spectrophotomètre, la méthode fluorométrique offre plusieurs avantages importants comme une augmentation significative de la sensibilité, une grande sélectivité pour l’ADN double brin (ADNdb) par rapport à l’ADN simple brin (ADNsb) ou l’ARN, et une tolérance accrue aux contaminants (protéines et glucides).
Voici quelques notes d'application sur la quantification des acides nucléiques qui peuvent se révéler intéressantes :
Détection du tryptophane
La fluorescence intrinsèque des protéines est due aux acides aminés aromatiques tryptophane, tyrosine et phénylalanine. Le tryptophane, qui s’excite au maximum aux alentours de 270-280 nm et qui a un pic d’émission près de 350 nm dans l’eau, domine l’émission des protéines et est le plus sensible à la polarité des solvants et à l’environnement local.
Dans ces notes d'application, nous démontrons la performance des lecteurs de microplaques multimode SpectraMax pour les tests mesurant la fluorescence du tryptophane intrinsèque.
Ressources sur la fluorescence
Note d'application
Détection du tryptophane intrinsèque avec la plateforme de microplaques multimode SpectraMax i3
Intrinsic tryptophan detection with the SpectraMax i3 Multi-Mode Microplate Platform
La fluorescence intrinsèque des protéines est due aux acides aminés aromatiques tryptophane, tyrosine et phénylalanine. Le tryptophane, dont le seuil d’excitation maximum se situe approximativement entre 270 et 280 nm, a…
Note d'application
Réaliser une solution de flux de travail cAMP en utilisant le Kit de test fluorescent CatchPoint cAMP
Complete cAMP workflow solution using the CatchPoint cAMP Fluorescent Assay Kit
Les GPCR, récepteurs couplés aux protéines G, sont des protéines transmembranaires importantes qui traduisent les signaux extracellulaires en réponses intracellulaires. Ces réponses intracellulaires se composent de…
Note d'application
Etude de l'activation du récepteur couplé aux protéines Gq sur le lecteur SpectraMax i3x avec un module d'injecteur
Monitoring Gq protein-coupled receptor activation on the SpectraMax i3x reader with injector module
L’activation des récepteurs couplés aux protéines Gq est couramment surveillée en temps réel dans les cellules vivantes en utilisant des colorants sensibles au calcium sur un lecteur de microplaques à fluorescence. Manipulation automatisée des liquides dans…
Note d'application
Test de flux du calcium pour les études de neurotoxicité in vitro et le criblage de médicaments
Calcium flux assay for in vitro neurotoxicity studies and drug screening
L’imagerie du calcium, ou le suivi des variations du taux de calcium intracellulaire, est une technique extrêmement utile pour étudier les divers rôles joués par les ions calcium dans les neurones qui fonctionnent…
Note d'application
Mesure de la fluorescence intrinsèque du tryptophane sur le lecteur de microplaques SpectraMax iD3
Measure intrinsic tryptophan fluorescence on the SpectraMax iD3 microplate reader
La fluorescence intrinsèque des protéines est due aux acides aminés aromatiques tryptophane, tyrosine et phénylalanine. Le tryptophane, dont le seuil d’excitation maximum se situe approximativement entre 270 et 280 nm, a…
Note d'application
Détermination de la santé des cellules par des tests de viabilité cellulaire utilisant le lecteur SpectraMax iD3
Measuring cell health on the SpectraMax iD3 reader with cell viability assays
La détermination de la santé des cellules à partir de divers paramètres de viabilité et les voies apoptotiques peuvent donner un aperçu des effets produits par divers traitements expérimentaux, notamment…
Note d'application
Utilisation du kit NanoOrange Protein avec les lecteurs de microplaques SpectraMax
Using the NanoOrange Protein Kit with SpectraMax Microplate Readers
Cette note d’application décrit l’utilisation du kit de quantification des protéines NanoOrange® Protein de Life Technologies sur les lecteurs de microplaques SpectraMax® avec le mode de détection par fluorescence et…
Note d'application
Tests à paramètres multiples pour les cardiomyocytes sur une seule plateforme
Multiparametric assays for cardiomyocytes on a single platform
Récemment, il a été démontré que les changements du flux de calcium intracellulaire associés aux contractions des cardiomyocytes peuvent être surveillés sur un lecteur de microplaques d’imagerie par fluorescence (FLIPR Tetra…
Note d'application
Mesure de l’inhibition protéosomique dans des cellules vivantes sur les lecteurs de microplaques Analyst® GT, FLEXstation® et Gemini EM avec le capteur protéosomique BD Biosciences
Measurement of Proteosome Inhibition in Live Cells on the Analyst® GT, FLEXstation® and Gemini EM Microplate Readers Using the BD Biosciences Proteasome Sensor
Les protéines dans les cellules eucaryotes existent dans un état dynamique, dans un équilibre hautement régulé entre la synthèse et la dégradation. Même si la synthèse des protéines est bien comprise après des décennies…
Note d'application
Kit de test EarlyTox Gluthatione sur lecteurs de microplaques à fluorescence SpectraMax
EarlyTox Glutathione Assay Kit on SpectraMax Fluorescence Microplate Readers
L’apoptose est un programme cellulaire très régulé qui entraîne la mort des cellules dans des processus normaux tels que le développement embryonnaire, ainsi que dans des processus pathologiques, dont ceux du cancer et des maladies neurodégénératives…
Note d'application
Kit de test EarlyTox Live/Dead sur lecteurs de microplaques à fluorescence SpectraMax
EarlyTox Live/Dead Assay Kit on SpectraMax Fluorescence Microplate Readers
Les tests de viabilité cellulaire sont souvent effectués pour évaluer les effets d’un ensemble varié de traitements, notamment les médicaments candidats, les activateurs et les inhibiteurs des voies de signalisation, ainsi que les gènes rapporteurs. L’un des…
Note d'application
Quantification de l'ADN double brin à l'aide du réactif Quant-iT PicoGreen dsDNA et des lecteurs de microplaques en fluorescence SpectraMax
Quantitating Double-Stranded DNA with Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent and SpectraMax Fluorescence Microplate Readers
L’ADN double brin est généralement quantifié dans des lecteurs de microplaques en mesurant l’absorbance de la solution d’ADN à 260 nm. Toutefois, cette méthode ne peut mesurer qu’environ…
Note d'application
Optimisation d'un test sur le récepteur muscarinique M3 en utilisant des cellules CHO congelées sur le lecteur FlexStation 3
Optimization of a muscarinic M3-receptor assay using frozen CHO cells on the FlexStation 3 reader
Les tests cellulaires peuvent souvent être difficiles et fastidieux à réaliser. Afin de faciliter et de simplifier ce processus complexe, des cellules congelées, qui peuvent être analysées sans mise en culture préalable, ont…
Note d'application
Signalisation calcique avec les kits de test FLIPR Calcium 6 et 6-QF sur le lecteur FlexStation 3
Calcium signaling with FLIPR Calcium 6 and 6-QF Assay Kits on the FlexStation 3 reader
Les kits de test FLIPR® Calcium de Molecular Devices utilisent des indicateurs sensibles au calcium et des colorants masquants exclusifs vous permettant de réaliser des criblages fluorescents très sensibles…
Note d'application
Quantification d’échantillons d’ADN double brin à l’aide des kits de test d’ADNdb SpectraMax Quant
Quantitation of dsDNA samples using the SpectraMax Quant dsDNA Assay Kits
Comme différents types d’échantillons à tester peuvent contenir des concentrations différentes d’ADN, la sélection d’un réactif fluorescent approprié ayant la sensibilité et la plage de détection requises est…
Note d'application
Mesure de la prolifération cellulaire en utilisant le test de prolifération cellulaire CyQUANT avec les lecteurs de microplaques SpectraMax
Measuring cell proliferation using the CyQUANT Cell Proliferation Assay with SpectraMax Microplate Readers
La quantification de la prolifération cellulaire par fluorescence permet de surveiller facilement les effets des médicaments et autres traitements expérimentaux sur la croissance cellulaire. La prolifération cellulaire CyQUANT…
Note d'application
Test HTRF cAMP HiRange sur les lecteurs de microplaques multimode SpectraMax
HTRF cAMP HiRange Assay on SpectraMax Multi-Mode Microplate Readers
La technologie HTRF est une technologie polyvalente développée par Cisbio Bioassays pour détecter les interactions biomoléculaires1. Elle associe la technologie de transfert d'énergie par résonance de type Förster (FRET) à…
Note d'application
Analyse de signature spectrale de nanoparticules fonctionnalisées en surface
Spectral signature analysis of surface functionalized nanoparticles
La nanotechnologie, un domaine en plein essor, suscite l’intérêt de la communauté scientifique en raison de ses applications potentielles en recherche biomédicale. Actuellement, il y a…
Note d'application
Kit de test EarlyTox Caspase-3/7 R110 sur lecteurs de microplaques à fluorescence SpectraMax
EarlyTox Caspase-3/7 R110 Assay Kit on SpectraMax Fluorescence Microplate Readers
L’apoptose est un programme cellulaire très régulé qui entraîne la mort des cellules dans des processus normaux tels que le développement embryonnaire, ainsi que dans des processus pathologiques, dont ceux du cancer et des maladies neurodégénératives…
Affiche scientifique
Tests cellulaires à haut débit pour l'évaluation de la toxicité en utilisant le lecteur de microplaques SpectraMax® Paradigm
High Throughput Cell Based Assays for Toxicity Assessment using SpectraMax® Paradigm Plate Reader
La note d’application présente une comparaison de la performance des tests réalisés au moyen des différents modes de lecture du lecteur SpectraMax Paradigm et du système d’imagerie ImageXpress Micro.