Qu’est-ce que la fluorescence ?

La fluorescence est la propriété de certains atomes et molécules qui leur permet d’absorber la lumière à une longueur d'onde particulière (excitation : Ex) suivie d’une brève émission (Em) de lumière à une longueur d'onde plus longue (Figure 2). La distance entre les pics d’excitation et d’émission est appelée déplacement de Stokes (ou Stokes shift) et dépend du fluorophore (Figure 1).

La fluorescence implique une source de lumière externe pour exciter l’échantillon à une longueur d'onde particulière. Lorsque la molécule est excitée à la longueur d'onde appropriée, elle passe d’un état fondamental à un état excité. Lorsque la molécule retourne à l’état fondamental, de l’énergie est libérée sous forme de chaleur (perte d’énergie) et de lumière à une longueur d'onde plus longue différente d’énergie plus faible (Figure 3).

 

Déplacement de Stokes et dépendance au fluorophore

 

Figure 1

Excitation et émission brève

 

Figure 2

Longueur d'onde d’énergie plus faible

 

Figure 3

Comment fonctionne la détection de la fluorescence ?

Un lecteur de microplaques avec détection de l’intensité de la fluorescence (IF) utilise une source de lumière, généralement une lampe flash Xenon ou une LED, pour exciter un fluorophore (molécule fluorescente) à une longueur d'onde particulière. La longueur d'onde requise pour exciter l’échantillon peut être sélectionnée en utilisant un filtre d’une longueur d'onde spécifique ou un monochromateur réglé à la longueur d'onde requise.

Le fluorophore émet alors une lumière d’une longueur d'onde différente, sélectionnée par un second filtre ou monochromateur. La fluorescence émise est détectée par un tube photomultiplicateur (TPM), et l’intensité de la fluorescence de l’échantillon est exprimée en unités de fluorescence relative.

 

  • Fluoromètre vs spectrofluoromètre vs lecteur de microplaques à fluorescence

    Fluoromètre vs spectrofluoromètre

    Il existe de nombreux termes pour faire référence aux instruments utilisés pour mesurer la fluorescence d’un échantillon : fluoromètre, spectrofluoromètre, spectrophotomètre à fluorescence, spectromètre à fluorescence, fluorimètre, etc. 

    En général, ils utilisent une source de lumière pour exciter l’échantillon à une certaine longueur d'onde et mesurent la fluorescence émise à une seconde longueur d'onde. L’échantillon peut être conservé dans plusieurs formats, notamment cuvettes, capillaires et boîtes de Petri. « Lecteur de microplaques en fluorescence » fait référence à un instrument pouvant mesurer la fluorescence d’échantillons dans une microplaque, le plus souvent une microplaque à 96 ou 384 puits. Les microplaques permettent un débit plus élevé et sont utiles pour le criblage ou d’autres applications dans lesquelles de nombreux échantillons doivent être analysés.

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    Qu’est-ce qu’un spectrofluoromètre à double monochromateur ?

    Spectrofluoromètre à double monochromateur

    Certains lecteurs de microplaques en fluorescence utilisent des monochromateurs doubles plutôt que des filtres pour sélectionner la longueur d'onde de la lumière qui excite l’échantillon, ainsi que la longueur d'onde qui est émise par l’échantillon. Les monochromateurs utilisent un réseau de diffraction pour séparer spatialement les couleurs de la lumière et peuvent sélectionner un grand nombre de longueurs d'onde sans avoir à installer un filtre distinct pour chaque longueur d'onde requise par une application.

    Notre spectrofluoromètre à double monochromateur SpectraMax Gemini utilise deux monochromateurs de balayage pour la sélection de longueurs d'onde d’excitation et d’émission optimales.

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  • Dosages du calcium (GPCR)

    Dosages du calcium (GPCR)

    La signalisation cellulaire grâce aux récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) peut être évaluée en surveillant les effecteurs en aval comme l'AMP cyclique (AMPc) ou le calcium. Le flux de calcium en réponse à l’activation des récepteurs couplés aux protéines Gq est couramment surveillé en temps réel dans les cellules vivantes en utilisant des colorants sensibles au calcium sur un lecteur de microplaques en fluorescence.

    Voici quelques notes d'application sur les tests calcium (GPCR) qui peuvent se révéler utiles :

    Tests cAMP (GPCR)

    Tests cAMP (GPCR)

    La surveillance des taux de cAMP, un second messager produit en réponse à l’activation de l’adénylate cyclase, est l’une des façons les plus courantes de cribler les agonistes et antagonistes des récepteurs couplés aux protéines Gi/Gs. Les taux de cAMP peuvent être surveillés en utilisant des molécules fluorescentes qui se fixent au cAMP et sont détectées par un lecteur de microplaques en fluorescence.

    Voici quelques notes d'application sur les tests cAMP (GPCR) qui peuvent se révéler utiles :

  • Tests apoptose Caspase-3

    Tests apoptose Caspase-3

    L’apoptose est un programme cellulaire très régulé qui entraîne la mort des cellules dans des processus normaux tels que le développement embryonnaire, ainsi que dans des processus pathologiques, dont ceux du cancer et des maladies neurodégénératives. Les tests d’apoptose peuvent être réalisés avec un grand nombre de systèmes d’imagerie ou de systèmes de détection de lecteur de microplaques et fournissent des informations précieuses sur les mécanismes de mort cellulaire normaux et associés à des affections.

    En savoir plus sur le test homogène en une seule étape Caspase-3, spécialement conçu pour les lecteurs de microplaques :

    Tests de prolifération cellulaire

    Tests de prolifération cellulaire

    La quantification de la prolifération cellulaire par fluorescence permet de surveiller facilement les effets des médicaments et autres traitements expérimentaux sur la croissance cellulaire.

    Cette note d'application décrit deux méthodes de test de prolifération cellulaire. Dans la première méthode, la prolifération cellulaire est quantifiée à l’aide d’une courbe d’étalonnage cellulaire. Dans la seconde, la prolifération cellulaire est quantifiée en utilisant des échantillons cellulaires traités par RNase et une courbe d’étalonnage de l’ADN.

  • Tests de cytotoxicité

    Tests de cytotoxicité

    Le développement de tests in vitro prédictifs adaptés aux tests d’efficacité et de sécurité est particulièrement intéressant pour améliorer le processus de développement des médicaments et réduire l’attrition des médicaments. L’utilisation des cellules souches comme outils pour le criblage des composés au début du développement des médicaments suscite beaucoup d'intérêt.

    Sur cette affiche scientifique, nous présentons les résultats obtenus avec l’un de nos lecteurs de microplaques multimode pour l’évaluation de la toxicité de divers composés en utilisant des modèles cellulaires dérivés de cellules souches à haut débit :

    Test de cardiotoxicité EarlyTox

    Test de cardiotoxicité EarlyTox

    Les cardiomyocytes humains dérivés de cellules souches ont des caractéristiques phénotypiques et des profils électrophysiologiques similaires à ceux des cellules cardiaques humaines natives. Les cardiomyocytes en culture peuvent former un syncytium qui bat, se comportant comme les cardiomyocytes natifs. L’oscillation du taux de calcium intracellulaire survenant avec les contractions synchronisées des cellules peut être surveillée en utilisant un colorant sensible au calcium, et les modifications du modèle d’oscillation induites par le traitement peuvent être surveillées avec les changements du signal fluorescent dans le temps.

    Voici une note d'application qui peut se révéler intéressante :

  • Kits de test de viabilité cellulaire EarlyTox

    Kits de test de viabilité cellulaire EarlyTox

    Les tests de viabilité cellulaire sont essentiels dans de très nombreux domaines de recherche, de l’étude des mécanismes de la mort cellulaire au développement de nouveaux médicaments destinés à inhiber l’apoptose pathologique.

    Le lecteur de microplaques à fluorescence est l'une des technologies de détection privilégiées pour la viabilité cellulaire. Voici quelques applications qui peuvent se révéler intéressantes :

    Quantification des protéines par fluorescence

    Quantification des protéines par fluorescence

    Les protéines dans les cellules eucaryotes existent dans un état dynamique, dans un équilibre hautement régulé entre la synthèse et la dégradation. Même si l’on comprend bien la synthèse des protéines après des décennies d’étude, les connaissances sur la dégradation des protéines ont vraiment progressé au cours de ces vingt dernières années.

    En savoir plus sur la protéine fluorescente dans notre note d'application :

  • Analyse des nanoparticules

    Analyse des nanoparticules

    La nanotechnologie, un domaine en plein essor, suscite l’intérêt de la communauté scientifique en raison de ses applications potentielles en recherche biomédicale.

    Actuellement, il existe un nombre limité de techniques disponibles pour caractériser les nanoparticules et leurs interactions moléculaires. Ici, nous décrivons l’analyse de signature spectrale comme méthode de confirmation des interactions entre nanoparticules et molécules de surface.

    Flux de calcium neuronal

    Flux de calcium neuronal

    Le suivi des variations du taux de calcium intracellulaire est une technique extrêmement utile pour étudier les divers rôles joués par les ions calcium dans les neurones qui fonctionnent. Une mesure directe du flux de calcium dynamique dans les réseaux neuronaux révèle la façon dont les neurones traitent les signaux depuis l’espace extracellulaire.

    Cette note d'application démontre la faisabilité de la mesure du flux de calcium intracellulaire dans des neurones corticaux primaires de rat dans une microplaque fluorescente :

  • Quantification des acides nucléiques

    Quantification des acides nucléiques

    La quantification de l’ADN est une étape critique des méthodes de biologie moléculaire qui requiert une excellente précision et une grande fiabilité. Les méthodes actuelles doivent s'adapter à l’utilisation de volumes d’échantillon de plus en plus faibles pour des applications, telles que le séquençage nouvelle génération. En comparaison avec la quantification de l’ADN par spectrophotomètre, la méthode fluorométrique offre plusieurs avantages importants comme une augmentation significative de la sensibilité, une grande sélectivité pour l’ADN double brin (ADNdb) par rapport à l’ADN simple brin (ADNsb) ou l’ARN, et une tolérance accrue aux contaminants (protéines et glucides).

    Voici quelques notes d'application sur la quantification des acides nucléiques qui peuvent se révéler intéressantes :

    Détection du tryptophane

    Détection du tryptophane

    La fluorescence intrinsèque des protéines est due aux acides aminés aromatiques tryptophane, tyrosine et phénylalanine. Le tryptophane, qui s’excite au maximum aux alentours de 270-280 nm et qui a un pic d’émission près de 350 nm dans l’eau, domine l’émission des protéines et est le plus sensible à la polarité des solvants et à l’environnement local.

    Dans ces notes d'application, nous démontrons la performance des lecteurs de microplaques multimode SpectraMax pour les tests mesurant la fluorescence du tryptophane intrinsèque.

Ressources sur la fluorescence

Produits associés à la fluorescence