Qu’est-ce que le Western blot ?

Le test Western Blot est une technique populaire utilisée pour la détection et la quantification des protéines. Cette technique permet la séparation et l’identification d’une protéine d’intérêt spécifique dans un mélange complexe de protéines, par exemple, un lysat cellulaire. Avec des applications dans les domaines du diagnostic, de la biotechnologie, de la biologie moléculaire, de la protéomique, et bien plus encore, la technique Western Blot est largement utilisée pour évaluer le niveau d’expression des protéines dans les cellules, ainsi que les variations de taille et d’autres propriétés.

 

Méthodes Western Blot

Il existe plusieurs méthodes Western Blot selon l’anticorps secondaire utilisé. La détection de la protéine cible peut se faire par colorimétrie, chimioluminescence ou fluorescence. Ces méthodes sont décrites ci-dessous et requièrent différents équipements pour la détection. Par exemple, la chimioluminescence peut être détectée à l’aide d’un film radiographique ou d’un équipement d’imagerie numérique, tandis qu’un anticorps secondaire fluorescent requiert un imageur de fluorescence. Chaque type de détection présente des avantages et des inconvénients qui doivent être pris en compte lors de la sélection d’une méthode.

Une autre méthode que nous avons introduite, le système de détection par Western Blot ScanLater™, permet une détection par Western Blot unique en son genre sur une plateforme de lecteurs de microplaques multimode. En utilisant ce test sans substrat, vous pouvez obtenir une sensibilité équivalente aux tests de chimioluminescence conventionnels, tout en optimisant vos tests Western Blot et ELISA et d’autres applications en utilisant un seul et même lecteur. Nos notes d’application caractéristiques ci-dessous fournissent davantage de détails.

Cartouche de détection ScanLater pour Western Blot

Le système de détection par Western Blot ScanLater™ permet la détection par Western Blot sur un lecteur de microplaques

 

Flux de travail d’un test Western Blot

Voici les étapes utilisées pour un test Western Blot typique :

Flux de travail d’un test Western Blot

 

1. Réalisation d’une électrophorèse Les protéines sont tout d’abord triées par taille par électrophorèse sur gel.


2. Transfert Les protéines sont ensuite transférées vers une membrane de transfert, généralement en nitrocellulose ou PVDF, qui est sondée avec un anticorps primaire spécifique de la protéine d'intérêt.


3. Blocage avec un tampon de blocage Cela empêche la liaison de l’anticorps primaire (étape suivante) à la membrane elle-même.


4. Incubation avec l’anticorps primaire L’anticorps primaire se lie à la protéine cible.

5. Lavage avec un tampon de lavage L’anticorps primaire non lié est éliminé par lavage.


6. Incubation avec l’anticorps secondaire Un anticorps secondaire, qui reconnaît l’anticorps primaire et s’y lie, est ajouté. Cet anticorps secondaire est conjugué à une enzyme ou à un autre matériau permettant la détection de la protéine d’intérêt, qui apparaît sous forme de bande sur le transfert.


7. Lavage avec du tampon de lavage L’anticorps secondaire non lié est éliminé par lavage.


8. Détection avec la méthode/chimie choisie La protéine cible peut être détectée par colorimétrie, fluorescence ou luminescence, selon l’anticorps secondaire utilisé.

 

 

  • Western Blot par colorimétrie

    Western Blot par colorimétrie

    Une méthode Western Blot par colorimétrie utilise un anticorps secondaire conjugué à une enzyme et un substrat chromogénique pour la détection.

    Atouts :

    • Ne requiert aucun équipement spécial

    Inconvénients :

    • Sensibilité limitée (plage pg)
    • Les transferts ne peuvent pas être nettoyés et réutilisés pour étudier des cibles supplémentaires

    Western Blot par chimioluminescence

    Western Blot par chimioluminescence

    Un Western Blot par chimioluminescence utilise un anticorps secondaire conjugué à une enzyme et un substrat luminescent. Les résultats sont détectés à l’aide d’un film radiographique et d’un équipement en chambre noire, ou d’un système d’imagerie numérique.

    Atouts :

    • Sensibilité (taux fg)
    • Les transferts peuvent être nettoyés et réutilisés

    Inconvénients :

    • Les résultats peuvent être non linéaires
    • Le signal a une courte durée de vie
    • Les équipements requis pour la détection peuvent être onéreux et volumineux

  • Western Blot par fluorescence

    Western Blot par fluorescence

    Un Western Blot par fluorescence utilise un anticorps secondaire conjugué à un fluorophore, ainsi aucun substrat n’est requis. Un imageur par fluorescence est requis pour détecter les résultats.

    Atouts :

    • Gamme dynamique supérieure et meilleure linéarité par rapport aux méthodes par colorimétrie ou luminescence
    • Multiplex possible en utilisant des fluorophores différents

    Inconvénients :

    • Peut être moins sensible que la chimioluminescence
    • Requiert un système d’imagerie par fluorescence spécial

    Système de détection ScanLater Western blot

    Système de détection ScanLater Western blot

    Avec le système de détection par Western Blot ScanLater, l’anticorps secondaire est conjugué à un fluorophore en temps résolu, permettant d’associer les atouts des méthodes par fluorescence et par chimioluminescence.

    • Aucun substrat n’est requis pour la détection
    • Stabilité du signal pendant des mois, voire plus
    • Sensibilité à des niveaux inférieurs au picogramme
    • Large gamme dynamique

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  • Détection et quantification des protéines avec le système de détection ScanLater Western blot

    Détection de protéine ScanLater Western Blot Detection

    La détection des protéines est actuellement importante en recherche pharmaceutique et clinique, et les Western Blots font partie des méthodes les plus fréquemment employées. Diverses techniques sont utilisées pour détecter les protéines sur les membranes Western Blot, notamment la fluorescence et la chimiluminescence. Toutefois, chaque technique a ses propres limitations, et il est indispensable d’améliorer la quantification, la précision et la gamme dynamique.

    Cette note d’application démontre une gamme dynamique étendue en raison de la diminution du bruit de fond, ainsi qu’une stabilité de détection dans le temps et du nombre de lectures. En outre, une comparaison du système Scanlater Western Blot à une méthode par chimioluminescence montre une sensibilité améliorée.

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    Validez les cellules éditées par CRISPR à l’aide de l’imagerie et de la détection par Western Blot

    Validez des cellules  CRISPR par imagerie et détection Western Blot

    L’édition du génome a été largement utilisée pour étudier l’expression génique et la fonction des protéines, mais ces méthodes sont généralement laborieuses et inexactes1. Le système CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats [Courtes répétitions palindromiques groupées et régulièrement espacées])/Cas9 est un outil très populaire pour l’édition des gènes en raison de sa précision élevée et de sa facilité d’utilisation2.

    Ici, nous démontrons comment le lecteur de microplaques multimode SpectraMax i3x et le système ScanLater Western Blot Detection peuvent être utilisés pour valider l’édition du génome avec CRISPR/Cas9.

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  • Puits pour Western blot : Recherches sur la réponse au choc thermique cellulaire

    Puits pour Western blot : Réponse cellulaireau choc thermique

    L’étude d’une réponse cellulairepeut impliquer de multiples approches de collecte d'informations : imagerie, tests de prolifération et deviabilité cellulaires, Western Blot afin d'observer des changements dans l’expression des protéines, et bien plus encore. Plusieurs plateformes d’instruments sont souvent requises pour recueillir les résultats nécessaires, entraînant l'apprentissage de plusieurs progiciels durant le processus.

    Dans cette note d’application, nous montrons comment des données concernant plusieurs paramètres cellulaires liés ont été recueillies en utilisant un seul instrument, à savoir, la plateforme de détection multimode SpectraMax® i3.

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    Estimation du poids moléculaire des protéines avec l’échelle protéique ScanLater Western Blot

    Estimation des poids moléculaires des protéines

    L’échelle protéique ScanLater™ Western Blot est un composant essentiel de ce système de détection. Les principales applications de cette échelle protéique comprennent l’estimation du poids moléculaire des protéines, la visualisation de l’électrophorèse sur gel et l’évaluation du procédé de transfert du gel au transfert.

    Découvrez comment vous pouvez suivre le flux de travail de l’électrophorèse et du transfert optimisé pour votre application.

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  • Détection de protéine basée sur des protéines marquées à l’Europium

    Détection de protéine basée sur des protéines marquées à l’Europium

    Détection et quantification de protéines par transfert de Western à partir de protéines marquées à l'europium en utilisant un lecteur de plaques

    Ici, nous parlons d’un nouveau système pour l’analyse Western Blot qui est intégré dans un lecteur de microplaques multimode SpectraMax®. Les membranes sont sondées avec des anticorps secondaires marqués à l’Europium ou de la streptavidine marquant la protéine d’intérêt. L’Europium (Eu) a une longue durée de vie de fluorescence, de l’ordre de 1 msec, et la détection s'effectue en mode de détection par fluorescence en temps résolu (FTR), ce qui réduit significativement le bruit de fond issu de l’auto-fluorescence ou d’autres sources d'émissions de courte durée de vie.

Ressources sur le Western Blot

Vidéos et démos

Cartouche de détection ScanLater pour Western Blot

Le système de détection par Western Blot ScanLater™ permet la détection par Western Blot sur un lecteur de microplaques

Produits connexes du Western Blot