GPCR (récepteurs couplés aux protéines G)
Les GPCR, ou récepteurs couplés aux protéines G, sont des protéines situées à la surface des cellules qui reconnaissent les substances extracellulaires et transmettent des signaux à travers la membrane cellulaire. Les GPCR agissent en activant des protéines de liaison au nucléotide guanine (protéine G) qui sont responsables de la transduction du signal à l’intérieur de la cellule. La transmission des signaux est très importante dans diverses réactions cellulaires, notamment la croissance cellulaire, la transcription des gènes, les modifications post-translationnelles et la communication avec d’autres cellules. Cela entraîne des ajustements dans le corps pour s’adapter aux changements environnementaux, comme l’augmentation de la fréquence cardiaque lorsque l’on se sent menacé ou la modification de la vision en réponse à une faible luminosité.
Le génome humain compte à lui seul au moins 1 000 GPCR différents qui détectent notamment les hormones, les lipides, les amines, les neurotransmetteurs et la lumière, entre autres choses.
Un GPCR se compose de trois régions. La partie extracellulaire détecte le ligand et s’y fixe. Ensuite, la région à sept segments transmembranaires subit un changement conformationnel. Enfin, ce changement active l’extrémité C terminale qui déclenche la protéine G correspondante.

Les cardiomyocytes dérivés de cellules iPS sont des modèles cellulaires particulièrement intéressants car ils représentent des profils d’expression génétique ainsi que des caractéristiques phénotypiques similaires à celles des cellules cardiaques natives.
Récepteurs couplés aux protéines G et canaux ioniques
Les GPCR constituent la plus grande famille de protéines, comptant entre 600 et 1000 membres, et ont été associés à de nombreux états biologiques normaux ou pathologiques. Ils sont également connus sous le nom de récepteurs à sept domaines transmembranaires (7-TM) et constituent la cible d'environ 45 % des médicaments modernes. Les fonctions des GPCR sont très variées, ils reconnaissent en effet un grand nombre de ligands, notamment des photons, de petites molécules et des protéines.
Les canaux ioniques sont des pores dans la membrane cellulaire qui permettent aux ions de pénétrer dans la cellule et d’en sortir. Il existe plus de 400 gènes pour les canaux ioniques dans le génome humain. Nombre d’entre eux ont été ciblés par des médicaments qui sont à présent de grands succès. L’activité des canaux ioniques est directement mesurée avec des appareils d’électrophysiologie traditionnelle pour la méthode patch-clamp. Toutefois, le débit est très faible. L’activité des canaux ioniques peut également être mesurée indirectement, avec un débit beaucoup plus élevé, en utilisant des fluorophores sensibles aux variations du potentiel membranaire, du flux de calcium et du flux de potassium.
Surveiller l’activité des GPCR pour la découverte de médicaments
Les variations de l’activité des GPCR entraînent des anomalies dans les voies de signalisation cellulaire, qui se traduisent par une inflammation, des maladies cardiovasculaires, des troubles mentaux, des déséquilibres hormonaux et des cancers. C’est pourquoi les GPCR sont au centre de la découverte de médicaments, 34 % environ de tous les médicaments approuvés par la FDA ciblant des GPCR bien définis.
Divers tests peuvent être utilisés dans la découverte de médicaments pour surveiller l’activité des GPCR et les changements intracellulaires correspondants.
Le calcium est un messager important déclenché par l’activité des GPCR. Par conséquent, les variations de la signalisation du calcium intracellulaire constituent des indicateurs forts de l’état d’activation des GPCR. Les tests de flux de calcium peuvent être utilisés pour surveiller les taux de calcium intracellulaire dans le cadre du criblage de médicaments.
La surveillance des oscillations du calcium est également essentielle pour prédire la toxicité in vitro de vos médicaments candidats.
L’adénosine monophosphate cyclique (cAMP) est un autre messager important impliqué dans les voies de transduction du signal. La variation des niveaux intracellulaires de cAMP indique le couplage spécifique entre des GPCR et des protéines G. Les tests de cAMP peuvent fournir des informations précieuses sur les sous-types de GPCR.
Il est également possible de surveiller l’activité des GPCR par le biais d’essais Transfluor, dans lesquels l’accent est mis sur la désensibilisation des GPCR lors de la liaison au ligand. Ces essais peuvent être mis en œuvre dans le cadre du criblage de médicaments pour surveiller l’activation/désactivation des GPCR et leur mouvement à travers la membrane cellulaire.
Solutions pour l’identification de début de pistes par rapport aux GPCR
Nous proposons différentes solutions detest et instrumentales d’appui aux études de la fonction des GPCR et des canaux ioniques, notamment des kits de test, des systèmes d’imagerie et de criblage cellulaire, ainsi que des lecteurs de microplaques.
Nous nous concentrons ici sur les applications utilisant le système de criblage cellulaire à haut débit FLIPR, le module logiciel Screenworks Peak Pro 2 ainsi que divers kits de test FLIPR pour fournir une solution de criblage cinétique haut débit pour la toxicologie et l’identification des chefs de file.
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Cardiomyocyte
La prédiction précoce d’une cardiotoxicité fonctionnelle induite par un médicament requiert des systèmes in vitro robustes adaptés au criblage à haut débit. Des cardiomyocytes humains dérivés d’iPSC facilement disponibles peuvent être utilisés en conjonction avec des colorants sensibles au calcium. Les fréquences et profils de battement étant surveillés comme changements du calcium intracellulaire en réponse à la fois aux GPCR et aux canaux ioniques. Ces pics de calcium peuvent être analysés avec notre logiciel ScreenWorks Peak Pro 2 qui offre une série d’outils puissants pour la quantification de l’activité des cardiomyocytes.
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Cardiotoxicité : oscillations du calcium
Les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) constituent un système modèle in vitro particulièrement intéressant en raison de leur utilisation pour l’évaluation des effets des composés à la fois sur la fonction et la sécurité cardiaques. L’oscillation du signal calcique reflète les variations de la concentration de calcium cytoplasmique, ce qui permet d’utiliser un colorant sensible au calcium tel que le kit EarlyTox™ Cardiotoxicity.
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Évaluation du flux de calcium
L’évaluation du flux de calcium est une mesure largement acceptée, éprouvée et réelle de l’activité cellulaire. Le flux du calcium peut être utilisé comme mesure de processus cellulaires tels que la libération de neurotransmetteurs, l’activité des GPCR, les canaux ioniques régulés par un ligand et les profils de contraction des cardiomyocytes, entre autres. Grâce à sa convivialité, sa sensibilité et sa facilité de paramétrage par l’utilisateur, le système FLIPR constitue l’outil par excellence d’évaluation du flux du calcium dans le criblage à haut et ultra-haut débit dédié à la découverte de médicaments.
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Fura-2 QBT Calcium
Le colorant Fura-2 est depuis longtemps considéré comme un outil important de mesure de la mobilisation du calcium dans l’imagerie cellulaire, le flux du calcium intracellulaire médié par les GPCR et l’activation des canaux ioniques. Ce colorant ratiométrique permet de corriger les incohérences du test en ce qui concerne la charge du colorant ou la mise en plaque des cellules en calculant le rapport d’intensité de fluorescence entre les indicateurs liés et les indicateurs libres. Toutefois, un lavage est nécessaire, ce qui augmente la variabilité d’un puits à l’autre et ajoute du temps et de la complexité à chaque test.
Le kit de test Fura-2 QBT™ Calcium de Molecular Devices intègre une technologie de désactivation éprouvée avec un indicateur ratiométrique du calcium Fura-2 fournissant un test homogène afin de minimiser la variabilité cellulaire, tout en augmentant le débit par l’élimination du lavage des cellules avant la détection.
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Solution homogène pour tests GPCR
Les tests cellulaires sont devenus la méthode indispensable pour le criblage et le profilage des composés au début du processus de découverte de médicaments. À ce jour, ces tests se sont révélés être parmi les méthodes les plus fiables et les plus reproductibles dans les études de caractérisation des récepteurs, les campagnes de criblage primaire et les programmes de profilage des composés. Pour les cibles GPCR couplées aux protéines Gq spécifiquement, les tests de flux du calcium fluorescents homogènes avec technologie de masquage constituent la méthode de choix.
En associant un nouveau fluorophore et une technologie de colorant masquant éprouvée, le kit de test 5FLIPR Calcium permet une pharmacologie fiable, une fenêtre de signal plus grande et une meilleure performance du test. Avec le kit de test FLIPR Calcium 5 et le système FLIPR, vous pouvez obtenir un criblage uniforme d’une diversité de récepteurs et de cibles, tout particulièrement ceux répondant peu au signal calcique, dans un format homogène facile à utiliser.
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Signalisation par second messager de GPCR couplés aux protéines Gi et Gs de cellules vivantes
La détection de l’activité des signaux des messagers secondaires GPCR couplés aux protéines Gi et Gs est traditionnellement réalisée en utilisant des tests tels que parliaison radioactive ou les tests cAMP en point final qui requièrent une lyse cellulaire. Ces tests mesurent l’activité à un point de capture dans le temps unique dans la réponse cellulaire et ne fournissent pas d’informations sur la cinétique. Une autre option utilise le couplage forcé des GPCR couplés aux protéines Gi et Gs à Gα16, suivi d’une détection de fluorescence du flux de calcium par rapport à l’activation des récepteurs agonistes. De nouveau, ce test n’est pas optimal car il ne transmet pas le signal via la voie cAMP biologiquement pertinente.
Ici, nous démontrons l’activité endogène des récepteurs dans les lignées cellulaires CHO-K1 et HEK-293 exprimant de façon stable le plasmide GloSensor™ en utilisant le système FLIPR.
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Tests cinétiques sur cellules vivantes
Les systèmes d’imagerie haut contenu ImageXpress Confocal et Micro 4 offrent des modules de contrôle environnemental et fluidiques optionnels, permettant le pipetage à canal unique pour l’ajout de composés et le changement de milieu pendant les expériences cinétiques rapides ou séquentielles prolongées. Le kit de test cellulaire GPCR Transfluor est utilisé pendant le criblage haut contenu (HCS) afin de suivre l’activation des récepteurs couplés aux protéines G (GPCR). Pour ce faire, le kit de test quantifie la désensibilisation et le recyclage des GPCR en utilisant de la ß-arrestine marquée par GFP et une analyse automatisée des images.
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Mesure du flux de calcium intracellulaire
Les GPCR (récepteurs couplés aux protéines G) jouent un rôle important dans la signalisation cellulaire. Lorsque le récepteur est activé par un ligand, sa conformation est modifiée, ce qui déclenche une activation des protéines G dans la cellule. Une protéine G active peut induire diverses cascades de messagers intracellulaires, notamment le calcium. Le système FLIPR permet d’exécuter des tests cellulaires fonctionnels haut débit et représente le système de choix dans la découverte de médicaments car il permet d’évaluer les variations détectées dans le calcium intracellulaire en utilisant des colorants rapporteurs fluorescents sensibles aux variations du calcium. Ici, nous fournissons un protocole de base pour réaliser un dosage de mobilisation du calcium sur le système FLIPR en utilisant le kit de test FLIPR® Calcium, un test de fluorescence homogène, rapide et fiable.
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Suivi de l’activité des récepteurs couplés aux protéines Gq
L’utilisation d'un lecteur de plaques de fluorescence et de colorants sensibles au calcium constitue la méthode la plus commune de suivi de l'activation des récepteurs couplés aux protéines Gq. La manipulation automatisée des liquides dans le lecteur de plaques est généralement requise pour distribuer des composés agonistes aux cellules dans la microplaque tandis que le système de détection réalise des lectures en temps réel des variations des valeurs d’intensité de la fluorescence induites par les composés. L’analyse des lectures cinétiques qui en résultent donne des informations sur les profils de réponse des composés, notamment les valeurs CE50 et CI50 pour les agonistes et antagonistes.
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Tests neuronaux
Le système FLIPR est un excellent outil de suivi du flux de calcium lié à l’activité neuronale. Grâce aux neurones iPSC nouvellement développés, maintenant disponibles sur le marché, le criblage neuronal à haut débit est devenu réalité. Ces cellules et essais sont essentiels au suivi de nombreux facteurs, notamment les conditions de cultures des cellules neuronales, les effets des composés médicamenteux et l’effet des neurotoxines environnementales. L’activité neuronale et la libération de neurotransmetteurs peuvent être évaluées à l'aide de colorants fluorescents sensibles au calcium associés à des essais rapides, simples et puissants présentant un débit évolutif.
En savoir plus :
- Profilage de la neurotoxicité avec des sphéroïdes neuronaux 3D dérivés d’iPSC humaines
- Caractérisation phénotypique des effets des composés neuroactifs
- Tests multiplexés pour l’évaluation de la neurotoxicité en utilisant des modèles cellulaires 3D neuronaux
- Analyse d'événements complexes pour le profilage neurotoxique des effets de composés sur des cultures de sphéroïdes neuronaux 3D provenant d’iPSC humaines
Dernières ressources
Ressources sur les GPCR (récepteurs couplés aux protéines G)
Note d'application
Caractérisation phénotypique des effets des composés neuroactifs
Phenotypic characterization of neuroactive compound effects
Le système FLIPR Penta est alimenté par une caméra EMCCD haute vitesse et le nouveau logiciel ScreenWorks Peak Pro 2. Le système permet la mesure et l’analyse de modèles complexes de…
Affiche scientifique
Tests automatisés multiplexés pour l’évaluation de la neurotoxicité en utilisant des modèles cellulaires 3D dérivés de cellules souches pluripotentes induites
Multiplexed automated assays for neurotoxicity evaluation using induced pluripotent stem cell-derived neural 3D cell models
Les tests phénotypiques cellulaires constituent des alternatives de plus en plus attrayantes aux tests in vitro et in vivo traditionnels dans le développement de médicaments et l’évaluation de la sécurité toxicologique.
Affiche scientifique
Analyse d'événements complexes pour le profilage neurotoxique des effets de composés sur des cultures de sphéroïdes neuronaux 3D provenant d’iPSC humaines
Complex event analysis for neurotoxic profiling of compound effects on human iPSC-derived neural spheroid 3D cultures
Pour accélérer le développement de médicaments plus efficaces et plus sûrs, il existe un intérêt croissant pour des tests cellulaires plus complexes, biologiquement pertinents et prédictifs pour la découverte de médicaments et…
Note d'application
Évaluation à paramètres multiples des effets pro-arythmiques induits par des composés dans des cardiomyocytes dérivés d’iPSC humains
Multi-parametric assessment of compound-induced pro-arrhythmic effects in human iPSC-derived cardiomyocytes
Le développement de tests cellulaires biologiquement pertinents et prédictifs pour le criblage de composés et l’évaluation de la toxicité est l’un des enjeux majeurs de la découverte de médicaments.
Affiche scientifique
Profilage de la neurotoxicité avec des sphéroïdes neuronaux 3D dérivés d’iPSC humaines
Neurotoxicity profiling using 3D human iPSC-derived neural spheroids
Analysez les effets des composés et criblez les substances chimiques neurotoxiques avec des sphéroïdes neuronaux 3D.
Note d'application
Mesurez l’oscillation du calcium avec iCell cardiomyocytes2 sur le système FLIPR Tetra
Measure Calcium Oscillation in iCell Cardiomyocytes2 on the FLIPR Tetra System
Raccourcissez les temps de croissance lorsque vous criblez des effets des composés sur des transitoires calciques dans des cardiomyocytes battants en utilisant le kit iCell® Cardiomyocytes2 (Cellular Dynamics International). iCell…
Affiche scientifique
Kit calcium ratiométrique Fura-2 QBT, un test homogène pour la mesure des tests de flux de calcium sur le système FLIPR Tetra et le lecteur de microplaques FlexStation 3
Fura-2 QBT Ratiometric Calcium Kit, a Novel Homogeneous Assay for Measuring Calcium Flux Assays on the FLIPR Tetra System and the FlexStation 3 Microplate Reader
Ce PDF présente le kit pour le calcium ratiométrique Fura-2 QBT qui permet d’économiser du temps et les coûts relatifs aux tampons. Grâce à ce kit, la variabilité entre puits est réduite et la fenêtre de signal est plus importante.
Note d'application
Kit Calcium Fura-2 QBT : un test homogène Fura-2 de dosage du calcium
Fura-2 QBT Calcium Kit: A homogenous Fura-2 calcium assay
Le kit de test Fura-2 QBT Calcium de Molecular Devices intègre une technologie de désactivation éprouvée avec un indicateur de calcium ratiométrique Fura-2 permettant un test homogène afin de minimiser…
Note d'application
Améliorez vos criblages du calcium grâce aux kits d'essais FLIPR Calcium 6
Enhance your calcium screens with FLIPR Calcium 6 Assay Kits
Les kits d'essais FLIPR Calcium de Molecular Devices utilisent des indicateurs sensibles au calcium et des colorants masquants exclusifs permettant de réaliser des criblages fluorescents très sensibles de G…
Note d'application
Signalisation de messager secondaire GPCR couplé à Gi et Gs de cellules vivantes sur le système FLIPR Tetra
Live cell Gi- and Gs -coupled GPCR second messenger signaling on the FLIPR Tetra System
Dans ce protocole d’application, nous faisons la démonstration de l’utilisation du test cAMP Promega GloSensor™ (basé sur la luciférase Firefly luminescente modifiée) sur le criblage cellulaire haut débit FLIPR Tetra®…
Note d'application
Solution homogène pour essais GPCR avec le kit FLIPR Calcium 5
Homogeneous solution for GPCR assays with FLIPR Calcium 5 Assay Kit
En associant un nouveau fluorophore et une technologie de masquage éprouvée, le kit d'essai FLIPR Calcium 5 permet une pharmacologie fiable, une fenêtre de signal plus grande et une meilleure performance de l'essai. Avec…
Note d'application
Essais de cardiotoxicité à haut débit utilisant des cardiomyocytes dérivés de cellules souches
High throughput cardiotoxicity assays using stem cell-derived cardiomyocytes
Éliminez les composés cardiotoxiques et identifiez les médicaments candidats potentiels plus tôt dans le processus de découverte de médicaments grâce au système FLIPR Tetra associé au logiciel ScreenWorks Peak Pro…
Note d'application
Comparaison des mesures du calcium intracellulaire avec le kit d'essai FLIPR Calcium
Comparison of intracellular calcium measurements with FLIPR Calcium Assay Kit
Le système FLIPR Tetra offre une plateforme de criblage pour réaliser des tests cellulaires en mode cinétique en temps réel au format 96, 384 et 1536 puits. Quelle que soit la microplaque du système FLIPR Tetra…
Note d'application
Effets de composés sur les flux transitoires du calcium dans des cardiomyocytes battants dérivés de cellules iPS humaines Axiogenesis Cor.4U
Compound effects upon calcium transients in beating Axiogenesis Cor.4U human iPS cell-derived cardiomyocytes
L’évaluation de la cardiotoxicité est importante aux premiers stades de la découverte de médicaments afin d'éliminer les composés potentiellement toxiques du développement ultérieur. Ceci est essentiel pour réduire…
Note d'application
Etude de l'activation du récepteur couplé aux protéines Gq sur le lecteur SpectraMax i3x avec un module d'injecteur
Monitoring Gq protein-coupled receptor activation on the SpectraMax i3x reader with injector module
L’activation des récepteurs couplés aux protéines Gq est couramment surveillée en temps réel dans les cellules vivantes en utilisant des colorants sensibles au calcium sur un lecteur de microplaques à fluorescence. Manipulation automatisée des liquides dans…
Note d'application
Test cinétique sur cellules vivantes à l’aide du système ImageXpress Micro
Live cell kinetics assay utilizing the ImageXpress Micro System
Le système d’imagerie haut contenu et large champ ImageXpress® Micro Confocal/XLS de Molecular Devices inclut des modules optionnels de fluidique et de contrôle environnemental, permettant…
Affiche scientifique
Essais cellulaires sur le système FLIPR® Tetra : Comparaison d’un nouvel essai FLIPR® Calcium à d’autres essais de flux de calcium par fluorescence
Cell Based Assays on the FLIPR® Tetra System: Comparison of a Novel FLIPR® Calcium Assay to other Fluorescence based Calcium Flux Assays
Essais cellulaires sur le système FLIPR Tetra pour comparer un nouveau essai FLIPR Calcium 6 et 6-QF à d’autres essais de flux de calcium par fluorescence