Édition génomique (CRISPR/Cas9) Avancées récentes pour améliorer le potentiel clinique
Plus de gènes 3000 humains ont été fortement corrélés au cancer et aux maladies génétiques. L’élucidation des mutations génétiques et des maladies humaines devient de plus en plus urgente. La méthode d’édition génomique la plus fonctionnelle a peut-être été influencée par un mécanisme de réponse immunitaire adaptatif, par lequel les bactéries capturent et clivent l’ADN viral pour se protéger contre les attaques virales. Le mécanisme a ensuite été adapté par Doudna et Charpentier et al. et a été nommé système combiné de répétition palindromique courte régulièrement espacée (CRISPR)/associé à CRISPR (Cas) pour étudier les altérations génomiques chez l’homme. Aujourd’hui, l’édition génétique CRISPR/Cas fait partie intégrante de la découverte de médicaments basés sur des gènes pour découvrir les gènes cibles et réaliser des knockouts, ce qui permet d’avoir un aperçu du phénotype obtenu. De ce point de vue, cette technologie est une étape importante vers la corrélation entre le génome du patient et le phénotype et l’autonomisation de la médecine de précision.
Comme toutes les autres modalités génomiques, la thérapie génique CRISPR/Cas doit être administrée de manière efficace et conviviale pour le patient. Cependant, les méthodes actuelles de distribution de gènes ont démontré des effets hors cible et un manque d’efficacité de destruction.
Dans ce podcast sur la revue des cibles médicamenteuses, le Dr Pietro De Angeli, l’Institut de recherche ophtalmique de l’hôpital universitaire de Tübingen, et le Dr Maarten, le Centre Princess Maxima, discutent des profils de sécurité des méthodes d’9administration de CRISPR/Cas, ainsi que des tendances actuelles concernant l’évolutivité et l’utilisation des méthodes d’intelligence artificielle (IA).
Plongez dans la conversation où nous discutons des opportunités offertes par la technologie CRISPR/Cas pour révolutionner la découverte de médicaments génétiques.
Profils de sécurité ciblés : ADN, ARNm et RNP dans l’administration de CRISPR/Cas
Pour que l’édition du gène CRISPR/Cas9 fonctionne de manière transparente, le complexe doit atteindre le noyau, où il peut localiser les gènes cibles.
L’administration de CRISPR est médiée par l’ADN plasmidique (ADNp), l’ARNm ou les ribonucléoprotéines (RNP), et les deux premières imposent des problèmes de sécurité. L’administration par l’ADN plasmidique ou l’ARNm peut souvent entraîner l’activation de la réponse immunitaire innée, et l’ADNp présente un risque supplémentaire d’incorporation dans le génome hôte, entraînant des effets indésirables à long terme. Bien que les stratégies ex vivo puissent aider à prédire et à atténuer ces risques, la spécificité de CRISPR/Cas9 reste non résolue.
Mécanisme CRISPR/Cas9. L’enzyme Cas9 est activée en se liant d’abord à un ARN guide, puis en se liant à la séquence génomique correspondante qui précède immédiatement la séquence de 3 nucléotides appelée PAM. L’enzyme Cas9 crée alors une cassure double brin, et la voie NHEJ ou HDR est utilisée pour réparer l’ADN, ce qui donne une séquence génétique modifiée.
Pour réduire les risques liés à l’édition génétique, les chercheurs se tournent vers les RNP, composés de la protéine Cas9 dans un complexe avec un ARNg cible. Cette méthode d’administration offre une spécificité et une sécurité améliorées. À ce jour, Maarten indique la corrélation inverse entre le temps passé par les complexes dans l’hôte et la précision de l’édition du gène CRISPR/Cas9 : « mRNA ou pour l’ADN, il faut jusqu’à une semaine pour la transcription et la traduction de Cas9, tandis qu’un RNP est actif dès qu’il pénètre dans le noyau et peut faire le travail en moins de 24 heures. Plus le Cas9 reste long dans le noyau, plus il est probable qu'il trouve et s'accumule des sites hors cible. C’est pourquoi la méthode d’édition génétique la plus sûre consiste à donner une impulsion Cas9 très courte via RNP. » Un autre avantage des RNP est la facilité d’optimisation, ajoute Pietro. « Lorsque vous utilisez des RNP, il est plus facile de régler la concentration de vos réactifs, ce qui a un impact sur l’efficacité de la cible. Alors que dans l’administration CRISPR basée sur l’ADN, l’efficacité de la transfection et le nombre de copies d’ADN sont difficiles à prédire et à affiner. »
Un autre défi posé par CRISPR/Cas9 à base d’ADN ou d’ARNm est qu’il pourrait altérer le profil transcriptomique et protéomique de l’hôte. Ce changement intervient principalement parce que l’hôte réorganise ses ressources énergétiques pour la transcription et la traduction des formes d’ADN et d’ARNm. La charge métabolique qui en résulte peut perturber le métabolisme de l’hôte, qui modifie le transcriptome et le protéasome. À l’inverse, l’administration de CRISPR/Cas9 en tant que RNP est un complexe prêt à fonctionner et à exercer l’édition génétique souhaitée, de sorte qu’elle ne provoque pas de déplacement du génome vers l’expression de Cas9.
Applications ex vivo : Naviguer dans l’évolutivité et la faisabilité de CRISPR
Le système CRISPR/Cas9 ne peut pas être délivré au noyau comme un complexe nu, donc le véhicule de livraison CRISPR approprié joue un rôle important dans la protection de l’intégrité du complexe. Pour faire face aux efforts actuels, les chercheurs partagent le travail pionnier des laboratoires de recherche.
Le Professeur David Liu, vice-président de la faculté du Broad Institute of MIT et de Harvard, a conçu des nanoparticules lipidiques (NPL) d’origine virale qui peuvent encapsuler le complexe. Les NPL ont démontré une administration efficace dans toutes les formes de CRISPR/Cas9, y compris le NPR préformé. Cette machine a guidé la distribution du complexe à des organes d’intérêt spécifiques (Banskota et al., 2022, Cell 185, 250–265). Pendant ce temps, le laboratoire de Jennifer Doudna a amélioré la spécificité du site de Cas9 en ajoutant des signaux de localisation nucléique aux extrémités C et N de la protéine. Les expériences in vivo ont confirmé une édition génétique précise dans le cerveau de la souris (Stahl EC, et al., Mol Ther. -2 août
Alors que les méthodes d’administration continuent à s’améliorer, le potentiel clinique de l’édition génétique CRISPR/Cas9 n’a pas été pleinement réalisé, principalement parce que l’administration virale, associée à une édition prolongée hors cible, est toujours la référence. Parmi les méthodes d’administration non virales, l’électroporation se distingue par ses capacités d’administration sûres et robustes compatibles avec les RNP. Cette méthode crée des pores dans la membrane cellulaire, ce qui permet une pénétration sans faille de RNP dans le cytoplasme et empêche son endocytose ou son échappement endosomal.
Un autre ensemble de problèmes apparaît lorsqu’il s’agit d’évolutivité. Alors que l’endonucléase Cas9 peut être produite par lots importants sans trop de coûts, l’ARN guide (ARNg) est spécifique non seulement à la maladie ou à l’approche thérapeutique, mais également aux individus. Pietro pense que la voie vers le changement d’échelle de l’ARNg est marquée par des risques. « Pour le moment, ce que je considère comme un problème, ce n’est pas la technologie elle-même, mais plutôt le cadre juridique. Les grandes entreprises pharmaceutiques se concentrent sur les troubles les plus fréquents, car elles recherchent des opportunités commercialement viables. Un patient appartenant à ce groupe a plus de chance d’accéder aux traitements d’édition génétique. Pour le traitement des maladies rares, les établissements de recherche universitaires et à but non lucratif doivent s’efforcer de faciliter l’accès des patients. » Selon Maarten, la procédure réglementaire pour les maladies rares doit être différente : « Pour chaque maladie, la sécurité du complexe doit être démontrée par des données ex vivo substantielles. Pour les maladies rares avec un nombre limité de patients dans le monde, la génération de ce rapport complet n’est pas possible. Actuellement, les initiatives parrainées par Jennifer Doudna et d’autres experts de CRISPR sont en liaison avec la FDA afin d’assouplir les exigences en matière de données précliniques et de dépôt IND pour les maladies rares. » Cette proposition implique l’utilisation de l’édition génétique ex vivo pour générer des cellules modifiées qui peuvent être administrées aux patients, afin que l’édition génomique soit considérée comme un réactif plutôt qu’un médicament.
Améliorer la médecine de précision CRISPR : La synergie de CRISPR/Cas avec l’IA et le ML
Les outils d’apprentissage machine (ML) et d’IA, similaires à leur impact dans de nombreux autres secteurs, sont considérés comme des facteurs révolutionnaires dans l’édition génétique et la découverte de médicaments guidés par les gènes. Dans le cas de CRISPR/-Cas9, ils peuvent être utilisés pour assembler de grands ensembles de données d’éditions spécifiques au site et hors cible et les corréler à différents éditeurs de base ou structures RNP 3D. Les algorithmes d’apprentissage machine peuvent vous donner la séquence d’ARNg nécessaire pour cibler un gène spécifique ainsi que toutes les modifications au niveau des protéines nécessaires pour atteindre le niveau de spécificité. Ainsi, les chercheurs peuvent désormais concevoir l’ARNg le plus sûr et le plus efficace.
Des outils d’IA ont également été utilisés pour prédire l’efficacité de variantes plus évoluées de CRISPR/Cas9. Pour améliorer l’édition primaire, les chercheurs ont développé la nCas9 - nickase Cas9 fusionnée à la transcriptase inverse - afin de rationaliser divers types d’édition génomique, tels que les mutations ponctuelles, les insertions et les délétions. Bien que ce nouveau système génère une meilleure efficacité d’édition en théorie, sa conception et sa sécurité doivent être évaluées minutieusement, c’est là que la puissance prédictive des outils d’IA entre en jeu. Maarten souligne la valeur de l’IA dans la découverte de médicaments à base de gènes : « Cela nous aide à scanner des centaines de combinaisons d’ARNg Cas9 pour détecter celles qui sont les 10 plus performantes. »
L’avenir de CRISPR : Transformer les approches thérapeutiques
Le séquençage génomique traditionnel ne suffit pas à élucider le contexte génétique des maladies. Alors que les chercheurs peuvent isoler des cellules d’un patient et comparer le génome à des cellules saines, cette comparaison ne couvre pas nécessairement les milliers de mutations ponctuelles contribuant au phénotype de la maladie. L’édition génomique CRISPR/Cas9 aide à surmonter ces obstacles et bénéficie grandement d’une modélisation précise des maladies et d’une médecine personnalisée pour cibler des mutations spécifiques. Pour Pietro, le traitement n’est qu’un côté de la pièce : « Nous pouvons l’utiliser non seulement comme outil de traitement, mais aussi comme moyen de recherche sur les maladies. Les modèles cellulaires 3D, tels que les organoïdes dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC), sont incroyablement utiles pour émuler la biologie humaine complexe. Donc, en introduisant une mutation associée à la maladie dans le génome iPSC, nous pouvons générer des cultures cellulaires qui peuvent se différencier dans le phénotype de la maladie. » Cet aspect de CRISPR/Cas9 vaut la peine d’être étudié car le contexte génétique d’une maladie est primordial pour développer des outils thérapeutiques puissants.
Bien sûr, le rôle de la modélisation cellulaire 3D ne peut pas être exagéré. Grâce aux technologies de culture cellulaire 3D et à CRISPR/Cas9, les chercheurs peuvent générer des modèles cellulaires isogènes, qui englobent l’ensemble du paysage génomique avec des cellules extraites de seulement quelques patients.
Conclusion - Prochaines étapes de la recherche et de l’application de CRISPR
Les opportunités thérapeutiques débloquées par CRISPR/Cas9 sont vastes, en particulier dans l’édition de mutations ponctuelles et la réparation génétique ex vivo et, à l’avenir, in vivo. Cela peut accroître l’accès au traitement des patients atteints de maladies rares qui portaient auparavant des mutations difficiles à cibler.
Il est important de noter que CRISPR n’est pas une solution universelle. Particulièrement lorsque l’on parle de cancer, cela n’invalide pas la valeur des approches chimiothérapeutiques. À l’inverse, il peut créer un effet synergique en s’intéressant aux racines génomiques de la maladie, tandis que le composé médicamenteux inhibe les mécanismes associés à la maladie au niveau chimio-enzymatique. L’association de CRISPR avec des médicaments approuvés par la FDA peut accélérer son entrée dans les applications de traitement clinique du cancer.
Dans le podcast, nous avons exploré les méthodes d’administration CRISPR innovantes, notamment les RNP, les particules virales techniques et les formulations de nanoparticules, soulignant leur potentiel à propulser les applications CRISPR-Cas9 plus près de l’utilisation clinique. L’accent a été mis sur la nécessité de techniques d’édition génétique précises et efficaces. Pour soutenir ces avancées scientifiques, les systèmes d’imagerie haut contenu ImageXpress de Molecular Devices offrent des informations essentielles en permettant une observation détaillée de ces mécanismes de libération au sein des cellules. En outre, l’intégration d’outils tels que les lecteurs de microplaques SpectraMax et le système FLIPR Penta améliore notre compréhension de la croissance cellulaire, de la maintenance et des fonctionnalités, en particulier lorsque nous travaillons avec des modèles complexes tels que les organoïdes. Tout en discutant de l’importance de la rationalisation du processus de recherche, la conversation a également abordé le rôle de l’automatisation dans les laboratoires modernes. Des solutions telles que le système automatisé de culture cellulaire CellXpress.ai prennent en charge l’automatisation du processus de culture cellulaire, contribuant à des résultats plus fiables et reproductibles dans la recherche scientifique. Des solutions automatisées rationalisant le dépôt IND pendant le criblage clonal sont disponibles, telles que le système de repiquage de 2 colonies ClonePix avec assurance de monoclonalité. Les solutions d’automatisation de laboratoire personnalisées ont été mentionnées comme un moyen de collaborer avec les scientifiques, en adaptant les flux de travail pour répondre aux besoins spécifiques de leurs études CRISPR-Cas9, alignant ainsi les capacités technologiques avec la recherche de découvertes scientifiques révolutionnaires.