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Vue d’ensemble de TRF/TR-FRET (HTRF)

Fluorescence en temps résolu (TRF)

Les mesures d’intensité de la fluorescence (FI) utilisent des fluorophores standard comme la fluorescéine, dont l’émission est brève, de l’ordre des nanosecondes. L’excitation de l’échantillon et la mesure de l’émission ont lieu simultanément. Bien que les lecteurs de microplaques soient très efficaces pour écarter la lumière d’excitation de la mesure d’émission, cette lumière d’excitation, avec la brève lumière émise par les matériaux dans le puits ou l’échantillon, contribue souvent à un bruit de fond élevé.

La fluorescence en temps résolu (TRF) réduit le bruit de fond en utilisant un fluorophore lanthanidique, tel que l’europium ou le terbium, qui émet une fluorescence longue. Cette fluorescence longue dure plusieurs millisecondes. Par conséquent, l’excitation du fluorophore par une source lumineuse pulsée (p. ex., lampe flash), suivie d’un délai, puis de la mesure du signal (« fenêtre de comptage »), permet à la fluorescence brève (ne durant que quelques nanosecondes) de s’atténuer avant de réaliser une mesure. Les tests utilisant la fluorescence en temps résolu permettent d’obtenir des rapports signal/bruit significativement réduits. Les lanthanides les plus fréquemment utilisés sont l’europium, le terbium et le samarium. Ils sont généralement utilisés comme complexes de type chélate ou cryptate permettant une bonne intensité et une bonne stabilité du signal.

 

 

fluorescence en temps résolu

Transfert d’énergie par résonance de fluorescence en temps résolu (TR-FRET)

 

htrf-camp

Sans FRET

Le donneur et l’accepteur sont distants

FRET

Le donneur et l’accepteur sont très proches

Le TR-FRET combine la mesure de la fluorescence en temps résolu (TR) à la technologie de transfert d’énergie par résonance par fluorescence (FRET). Dans les tests FRET, des biomolécules (p. ex., protéines) sont marquées avec des fluorophores donneurs et accepteurs. Lorsque les biomolécules interagissent, les fluorophores donneurs et accepteurs se rapprochent. Lorsque le donneur est excité, il peut transférer son énergie d’émission à l’accepteur, qui, à son tour, émet une fluorescence à une longueur d’onde spécifique. Les émissions de fluorescence du donneur et de l’accepteur ont différentes longueurs d’onde pouvant être différenciées les unes des autres au moyen d’un lecteur de microplaques, ce qui permet la quantification de l’interaction biomoléculaire.

En utilisant comme donneurs des fluorophores lanthanidiques, qui ont une émission de fluorescence longue, les tests de TR-FRET tirent partie de la mesure de la fluorescence en temps résolu pour éliminer la fluorescence de fond brève. Dans un test TR-FRET, grâce à l’émission longue du fluorophore donneur, l’excitation et l’émission des fluorophores donneurs et accepteurs peuvent également être mesurées après que la fluorescence de fond brève a diminué.

Fluorescence homogène en temps résolu (HTRF)

TR-FRET

La technologie HTRF est une technologie TR-FRET polyvalente développée par Cisbio pour détecter les interactions biomoléculaires. Habituellement, le test HTRF utilise un cryptate d’europium comme donneur, et le fluorophore organique d2 comme accepteur. Le donneur et l’accepteur peuvent être utilisés pour marquer un grand nombre de biomolécules, pour des applications comprenant l’épigénétique, la quantification des biomarqueurs, la signalisation des GPCR, et bien plus encore. Les tests HTRF requièrent un lecteur de microplaques avec mode de détection TRF certifié compatible HTRF par Cisbio.

Avancées de nos clients

iTeos utilise nos lecteurs de microplaques multimode afin d'identifier des agents thérapeutiques ayant pour cible le micro-environnement immunitaire de la tumeur

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Avantages et éléments à prendre en considération

Un avantage clé de la détection TRF et TR-FRET est la diminution du bruit de fond et l’augmentation du rapport signal/bruit par rapport à la fluorescence standard, résultant en sensibilité accrue. En outre, le test est doté d’un format « mix-and-read » robuste ne nécessitant pas de lavage. Ceci, en plus de la stabilité du test, facilite l’automatisation et la miniaturisation pour les applications de criblage.

 

Applications et tests

Les tests TRF et TR-FRET (HTRF) permettent l’analyse des interactions moléculaires dans les processus biochimiques et sont largement utilisés pour étudier les tests d'activité kinase, les voies de signalisation cellulaire, les interactions protéine-protéine, les interactions ADN-protéine, la cytotoxicité cellulaire et la liaison ligand-récepteur.

Des exemples de test TR-FRET sont présentés dans le tableau à droite, et vous trouverez ci-dessous plusieurs ressources sur la fluorescence en temps résolu.
 

Test Donneur Accepteur Longueurs d’onde
HTRF-Eu/rouge* Cryptate d’europium XL665 ou d2 Ex320 Em1 620/Em2 665
HTRF-Tb/rouge* Cryptate de terbium XL665 ou d2 Ex340 Em1 620/Em2 665
HTRF-Tb/vert* Cryptate de terbium fluorescéine ou GFP Ex340 Em1 620/Em2 520
Lanthascreen Tb** Chélate de terbium fluorescéine Ex340 Em1 490/Em2 520
Lanthascreen EU** Chélate d’europium Alexa Fluor 647 Ex320 Em1 620/Em2 665
LANCE (original)*** Chélate d’europium Surelight® APC Ex320 Em1 620/Em2 665
LANCE Ultra*** Chélate d’europium ULight Ex320 Em1 620/Em2 665

  • Test HTRF

    Test HTRF

    Les tests HTRF de Cisbio ont évolué afin d’englober les domaines des récepteurs couplés aux protéines G, des kinases et de la signalisation cellulaire, de l’épigénétique et des biomarqueurs. Un grand nombre de kits et de réactifs de la boîte à outils sont disponibles pour les interactions protéine-protéine, les tests des récepteurs nucléaires, la dimérisation des récepteurs, la liaison du ligand, l’internalisation des récepteurs, les tests enzymatiques, et bien plus encore.

    Le HTRF implique l’utilisation de deux fluorophores, un donneur et un accepteur, pour marquer les protéines ou les autres biomolécules d’intérêt. Lorsque les biomolécules interagissent, leur proximité permet le transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET) du fluorophore donneur vers le fluorophore accepteur. L’utilisation de cryptates de lanthanide fluorescents à longue durée de vie comme donneurs permet la détection en temps résolu des tests HTRF, réduisant la brève fluorescence de fond des composés et autres matériaux. La détection du FRET en temps résolu (TR-FRET) avec un lecteur de microplaques permet une lecture de la liaison biomoléculaire.

    Lecteurs de microplaques compatibles HTRF

    Lecteurs de microplaques compatibles HTRF

    Pour obtenir des résultats de HTRF optimaux, il faut un lecteur de microplaques ayant été validé comme répondant aux caractéristiques de performance HTRF définies par Cisbio. L’optique, la source d’énergie et les détecteurs d’un lecteur, ainsi que les paramètres utilisés pour détecter le HTRF, ont tous un impact sur la performance. Nos lecteurs utilisent des composants optimisés pour la détection du HTRF, notamment une cartouche de détection du HTRF pour le lecteur SpectraMax i3x et le lecteur de microplaques multimode Paradigm, ainsi qu’un module TRF amélioré plus des filtres validés pour le lecteur SpectraMax iD5.

    Le programme de certification HTRF de Cisbio garantit que les lecteurs portant le logo « compatible HTRF » répondent aux caractéristiques requises pour une performance HTRF optimale. Cette note technique présente les paramètres optimisés validés par Cisbio pour les lecteurs de microplaques compatibles HTRF de Molecular Devices.

  • Test HTRF Human TNFα

    Test HTRF Human TNFα

    Le kit de test Human TNFα permet la détermination quantitative directe du TNFα. Il utilise un test immunologique de type sandwich impliquant deux anticorps spécifiques : un anticorps anti-TNFα marqué avec du cryptate d’europium et un anticorps anti-TNFα marqué par XL665 ou d2. En présence de TNFα, les deux anticorps se lient au TNFα, rapprochant les deux marqueurs de façon qu’une TR-FRET a lieu (Figure 1). Le signal est proportionnel à la concentration de l’antigène dans l’échantillon.

    Dans cette note d’application, nous montrons comment le lecteur de microplaques multimode SpectraMax® Paradigm® est utilisé pour réaliser des tests fiables sans lavage des cytokines appuyés sur d’excellents facteurs Z.

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    Normaliser les dosages des cytokines HTRF pour la viabilité cellulaire

    Normaliser les dosages des cytokines HTRF pour la viabilité cellulaire

    Les cytokines pro- et anti-inflammatoires jouent un rôle central dans l’auto-immunité et les maladies inflammatoires et infectieuses. Elles jouent également un rôle clé dans les troubles du métabolisme et en oncologie, en particulier dans la réponse immunitaire antitumorale. La fluorescence homogène en temps résolu (HTRF) de Cisbio Bioassays offre une plateforme polyvalente pour la quantification de diverses cytokines et chimiokines.

    Cette note d’application démontre comment réaliser une analyse pertinente de la sécrétion de cytokines conjointement à la viabilité cellulaire avec le lecteur de microplaques multimode SpectraMax i3x® et le cytomètre d’imagerie SpectraMax® Minimax® 300.

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  • Mesurer le métabolisme oxydatif et l’activité glycolytique

    Mesurer le métabolisme oxydatif et l’activité glycolytique

    Pour survivre, les cellules requièrent de l’énergie sous forme d’ATP afin d'effectuer les processus biologiques les plus essentiels. Cette énergie est générée via la glycolyse et la respiration mitochondriale. Même si elle produisent toutes les deux de l’ATP, la glycolyse peut avoir lieu en l’absence d’oxygène, tandis que les mitochondries requièrent de l’oxygène pour l’étape finale de la phosphorylation oxydative (OXPHOS).

    Avantages de la note d’application :

    • Mesure en temps réel de l’appauvrissement en oxygène extracellulaire et de l’acidification dans les cellules et les micro-organismes mis en culture
    • Détection TRF sensible de deux flux de travail de test « mix-and-measure » simples
    • Acquisition et analyse des données plus rapides grâce aux protocoles SoftMax Pro préconfigurés

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    Tests HTRF cAMP dynamique 2 et IP-One

    Tests HTRF cAMP dynamique 2 et IP-One

    La performance du test HTRF sur le lecteur SpectraMax M5e est démontrée ici avec deux kits de test HTRF différents : test cAMP dynamique 2 et IP-One. Les récepteurs couplés aux protéines G transmettent leur signal via deux voies majeures : la régulation du cAMP et l’augmentation du taux de calcium intracellulaire déclenchée par l'IP3. Avec le kit cAMP dynamique 2, les taux de cAMP sont détectés à l’aide d’un anticorps monoclonal anti-cAMP marqué au cryptate d’europium et de cAMP marqué au d2. Le test IP-One a un format similaire et utilise un anticorps monoclonal spécifique à IP1, un métabolite en aval plus stable d’IP3 qui s’accumule dans les cellules de signalisation en présence de chlorure de lithium.

    Cette note d’application présente à la fois les données des tests cellulaires et les courbes standards générées avec les kits cAMP dynamique 2 et IP-One. Ces données HTRF démontrent l’excellente plage dynamique et les facteurs Z’ pouvant être obtenus avec le lecteur SpectraMax M5e.

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  • Test HTRF cAMP HiRange

    Test HTRF cAMP HiRange

    Veuillez cliquer ici pour agrandir l’image.

    Le kit HTRF cAMP HiRange permet la quantification de l’AMP cyclique (cAMP, adénosine 3’ cyclique, 5’–monophosphate) dans des échantillons cellulaires. La cAMP est un second messager essentiel dans la signalisation des récepteurs couplés aux protéines G (GPCR). Lors de la fixation du ligand à un GPCR, un changement de conformation a lieu, activant le récepteur qui, à son tour, active une protéine G.

    Dans cette note d’application, nous montrons comment les lecteurs de microplaques multimode SpectraMax® sont utilisés pour réaliser des tests HTRF® haut débit fiables avec d'excellents facteurs Z' et des valeurs de CE50 hautement reproductibles.

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    Paramètres optimisés pour les tests Transcreener TR-FRET

    Tests Transcreener TR-FRET

    Les tests Transcreener® TR-FRET sont des tests immunologiques compétitifs en une étape pour la détection directe des nucléotides avec un affichage du transfert d’énergie de résonance par fluorescence de type Förster en temps résolu dans les infrarouges lointains (TR-FRET). Découvrez comment optimiser les paramètres pour les tests Transcreener TR-FRET sur les lecteurs de microplaques multimode SpectraMax iD5 et i3x.

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Ressources sur la fluorescence en temps résolu TRF / TR-FRET (HTRF)

Produits et services connexes