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Vue d’ensemble de TRF/TR-FRET (HTRF)

Fluorescence en temps résolu (TRF)

Les mesures d’intensité de la fluorescence (FI) utilisent des fluorophores standard comme la fluorescéine, dont l’émission est brève, de l’ordre des nanosecondes. L’excitation de l’échantillon et la mesure de l’émission ont lieu simultanément. Bien que les lecteurs de microplaques soient très efficaces pour écarter la lumière d’excitation de la mesure d’émission, cette lumière d’excitation, avec la brève lumière émise par les matériaux dans le puits ou l’échantillon, contribue souvent à un bruit de fond élevé.

La fluorescence en temps résolu (TRF) réduit le bruit de fond en utilisant un fluorophore lanthanidique, tel que l’europium ou le terbium, qui émet une fluorescence longue. Cette fluorescence longue dure plusieurs millisecondes. Par conséquent, l’excitation du fluorophore par une source lumineuse pulsée (p. ex., lampe flash), suivie d’un délai, puis de la mesure du signal (« fenêtre de comptage »), permet à la fluorescence brève (ne durant que quelques nanosecondes) de s’atténuer avant de réaliser une mesure. Les tests utilisant la fluorescence en temps résolu permettent d’obtenir des rapports signal/bruit significativement réduits. Les lanthanides les plus fréquemment utilisés sont l’europium, le terbium et le samarium. Ils sont généralement utilisés comme complexes de type chélate ou cryptate permettant une bonne intensité et une bonne stabilité du signal.

 

 

Fluorescence en temps résolu (TRF)

Transfert d’énergie par résonance de fluorescence en temps résolu (TR-FRET)

 

Transfert d’énergie par résonance de fluorescence en temps résolu (TR-FRET)

Sans FRET

Le donneur et l’accepteur sont distants

FRET

Le donneur et l’accepteur sont très proches

Le TR-FRET combine la mesure de la fluorescence en temps résolu (TR) à la technologie de transfert d’énergie par résonance par fluorescence (FRET). Dans les tests FRET, des biomolécules (p. ex., protéines) sont marquées avec des fluorophores donneurs et accepteurs. Lorsque les biomolécules interagissent, les fluorophores donneurs et accepteurs se rapprochent. Lorsque le donneur est excité, il peut transférer son énergie d’émission à l’accepteur, qui, à son tour, émet une fluorescence à une longueur d’onde spécifique. Les émissions de fluorescence du donneur et de l’accepteur ont différentes longueurs d’onde pouvant être différenciées les unes des autres au moyen d’un lecteur de microplaques, ce qui permet la quantification de l’interaction biomoléculaire.

En utilisant comme donneurs des fluorophores lanthanidiques, qui ont une émission de fluorescence longue, les tests de TR-FRET tirent partie de la mesure de la fluorescence en temps résolu pour éliminer la fluorescence de fond brève. Dans un test TR-FRET, grâce à l’émission longue du fluorophore donneur, l’excitation et l’émission des fluorophores donneurs et accepteurs peuvent également être mesurées après que la fluorescence de fond brève a diminué.

Fluorescence homogène en temps résolu (HTRF)

Fluorescence homogène en temps résolu (HTRF)

La technologie HTRF est une technologie TR-FRET polyvalente développée par Cisbio pour détecter les interactions biomoléculaires. Habituellement, le test HTRF utilise un cryptate d’europium comme donneur, et le fluorophore organique d2 comme accepteur. Le donneur et l’accepteur peuvent être utilisés pour marquer un grand nombre de biomolécules, pour des applications comprenant l’épigénétique, la quantification des biomarqueurs, la signalisation des GPCR, et bien plus encore. Les tests HTRF requièrent un lecteur de microplaques avec mode de détection TRF certifié compatible HTRF par Cisbio.

Avancées de nos clients

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Avantages et éléments à prendre en considération

Un avantage clé de la détection TRF et TR-FRET est la diminution du bruit de fond et l’augmentation du rapport signal/bruit par rapport à la fluorescence standard, résultant en sensibilité accrue. En outre, le test est doté d’un format « mix-and-read » robuste ne nécessitant pas de lavage. Ceci, en plus de la stabilité du test, facilite l’automatisation et la miniaturisation pour les applications de criblage.

 

Applications et tests

Les tests TRF et TR-FRET (HTRF) permettent l’analyse des interactions moléculaires dans les processus biochimiques et sont largement utilisés pour étudier les tests d'activité kinase, les voies de signalisation cellulaire, les interactions protéine-protéine, les interactions ADN-protéine, la cytotoxicité cellulaire et la liaison ligand-récepteur.

Des exemples de test TR-FRET sont présentés dans le tableau à droite, et vous trouverez ci-dessous plusieurs ressources sur la fluorescence en temps résolu.
 

Test Donneur Accepteur Longueurs d’onde
HTRF-Eu/rouge* Cryptate d’europium XL665 ou d2 Ex320 Em1 620/Em2 665
HTRF-Tb/rouge* Cryptate de terbium XL665 ou d2 Ex340 Em1 620/Em2 665
HTRF-Tb/vert* Cryptate de terbium fluorescéine ou GFP Ex340 Em1 620/Em2 520
Lanthascreen Tb** Chélate de terbium fluorescéine Ex340 Em1 490/Em2 520
Lanthascreen EU** Chélate d’europium Alexa Fluor 647 Ex320 Em1 620/Em2 665
LANCE (original)*** Chélate d’europium Surelight® APC Ex320 Em1 620/Em2 665
LANCE Ultra*** Chélate d’europium ULight Ex320 Em1 620/Em2 665

  • Dosages des cytokines

    Test HTRF Human TNFα

    Les cytokines pro- et anti-inflammatoires jouent un rôle central dans les maladies auto-immunes, inflammatoires et infectieuses. Elles jouent également un rôle clé dans les troubles du métabolisme et en oncologie, en particulier dans la réponse immunitaire antitumorale. Les tests HTRF constituent une plateforme polyvalente pour la quantification de diverses cytokines et chimiokines et sont adaptés à la surveillance de la libération des cytokines et des chimiokines dans les expérimentations cellulaires. Avec le lecteur de microplaques multimode SpectraMax i3x et le cytomètre d’imagerie SpectraMax® MiniMax™ 300, vous pouvez mesurer la HTRF et la viabilité cellulaire, et confirmer la qualité du test en surveillant l’apparence des cellules.

    Découvrez nos ressources sur les dosages des cytokines :

    eBook : Des tests ELISA à l’épigénétique avec HTRF

    Des tests ELISA à l’épigénétique avec HTRF

    Surmontez les difficultés inhérentes à la détection HTRF grâce à des paramètres de lecteurs de microplaques optimisés et une analyse simplifiée.

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  • Tests HTRF cAMP, récepteurs couplés à Gαi/o

    Tests HTRF cAMP dynamique 2 et IP-One

    L’AMP cyclique (cAMP, adénosine 3’, 5’–monophosphate cyclique) est un messager secondaire dans la signalisation des GPCR. La production de cAMP est probablement la voie de transduction du signal la plus étudiée. Elle est impliquée dans les réponses aux entrées sensorielles, aux hormones, à la transmission nerveuse, et bien plus encore. Lors de la fixation du ligand à un GPCR, un changement de conformation a lieu, activant le récepteur qui, à son tour, active une protéine G. L’activation des récepteurs couplés à Gαi/o empêche l’adénylate cyclase de produire de la cAMP.

    Découvrez nos ressources sur Gαi/o

    Tests HTRF cAMP, récepteurs couplés à Gαs

    Tests HTRF cAMP

    L’AMP cyclique (cAMP, adénosine 3’, 5’–monophosphate cyclique) est un messager secondaire dans la signalisation des GPCR. La production de cAMP est probablement la voie de transduction du signal la plus étudiée. Elle est impliquée dans les réponses aux entrées sensorielles, aux hormones, à la transmission nerveuse, et bien plus encore. Lors de la fixation du ligand à un GPCR, un changement de conformation a lieu, activant le récepteur qui, à son tour, active une protéine G. La suite de la transduction du signal dépend du type de protéine G activée, mais l’activation de Gαs entraîne une régulation à la hausse de la cAMP par l’adénylate cyclase.

    Découvrez nos ressources sur Gαs

  • Test HTRF

    Test HTRF

    Les tests HTRF de Cisbio ont évolué afin d’englober les domaines des récepteurs couplés aux protéines G, des kinases et de la signalisation cellulaire, de l’épigénétique et des biomarqueurs. Un grand nombre de kits et de réactifs de la boîte à outils sont disponibles pour les interactions protéine-protéine, les tests des récepteurs nucléaires, la dimérisation des récepteurs, la liaison du ligand, l’internalisation des récepteurs, les tests enzymatiques, et bien plus encore.

    Le HTRF implique l’utilisation de deux fluorophores, un donneur et un accepteur, pour marquer les protéines ou les autres biomolécules d’intérêt. Lorsque les biomolécules interagissent, leur proximité permet le transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET) du fluorophore donneur vers le fluorophore accepteur. L’utilisation de cryptates de lanthanide fluorescents à longue durée de vie comme donneurs permet la détection en temps résolu des tests HTRF, réduisant la brève fluorescence de fond des composés et autres matériaux. La détection du FRET en temps résolu (TR-FRET) avec un lecteur de microplaques permet une lecture de la liaison biomoléculaire.

    Lecteurs de microplaques compatibles HTRF

    Lecteurs de microplaques compatibles HTRF

    Pour obtenir des résultats de HTRF optimaux, il faut un lecteur de microplaques ayant été validé comme répondant aux caractéristiques de performance HTRF définies par Cisbio. L’optique, la source d’énergie et les détecteurs d’un lecteur, ainsi que les paramètres utilisés pour détecter le HTRF, ont tous un impact sur la performance. Nos lecteurs utilisent des composants optimisés pour la détection du HTRF, notamment une cartouche de détection du HTRF pour le lecteur SpectraMax i3x et le lecteur de microplaques multimode Paradigm, ainsi qu’un module TRF amélioré plus des filtres validés pour le lecteur SpectraMax iD5.

    Le programme de certification HTRF de Cisbio garantit que les lecteurs portant le logo « compatible HTRF » répondent aux caractéristiques requises pour une performance HTRF optimale. Cette note technique présente les paramètres optimisés validés par Cisbio pour les lecteurs de microplaques compatibles HTRF de Molecular Devices.

  • Tests IP-One, récepteurs couplés à Gαq/11

    Tests IP-One, récepteurs couplés à Gαq/11

    La phospholipase C (PLC) est une autre cible commune des protéines G activées et joue un rôle essentiel dans divers processus. Par exemple, les récepteurs de la thrombine dans les plaquettes utilisent cette voie pour favoriser la coagulation du sang. Les tests immunologiques compétitifs IP-One de Cisbio détectent l’accumulation d’inositol monophosphate (IP1), un métabolite stable en aval d’IP3 induit par la stimulation de PLC suite à l’activation de récepteurs couplés à Gαq/11. Ce kit permet la caractérisation directe des agonistes et des antagonistes des récepteurs, dans les cellules adhérentes et en suspension.

    Dosages des kinases et tests épigénétiques

    Dosages des kinases et tests épigénétiques

    Les protéines kinases sont des enzymes qui jouent un rôle central dans diverses voies de transduction du signal impliquées dans le contrôle de la croissance, du métabolisme, de la différenciation et de l’apoptose des cellules. Les kinases constituent le deuxième groupe le plus important de cibles médicamenteuses après les GPCR. L’épigénétique est l’étude des changements phénotypiques héréditaires qui n’impliquent pas d’altérations des séquences nucléotidiques, par exemple, des changements tels que la méthylation de l’ADN et la modification des histones. Ces derniers ont été liés au développement de diverses maladies, notamment du cancer.

    Découvrez nos ressources sur les dosages des kinases et les tests épigénétiques :

  • Mesurer le métabolisme oxydatif et l’activité glycolytique

    Mesurer le métabolisme oxydatif et l’activité glycolytique

    Pour survivre, les cellules requièrent de l’énergie sous forme d’ATP afin d'effectuer les processus biologiques les plus essentiels. Cette énergie est générée via la glycolyse et la respiration mitochondriale. Même si elle produisent toutes les deux de l’ATP, la glycolyse peut avoir lieu en l’absence d’oxygène, tandis que les mitochondries requièrent de l’oxygène pour l’étape finale de la phosphorylation oxydative (OXPHOS). Le fait de comprendre comment ces voies répondent aux composés effecteurs peut fournir des données utiles sur la fonction globale des cellules et les mécanismes sous-jacents qui déterminent le devenir des cellules.

    Lisez notre note d’application pour en savoir plus sur l’acquisition et l’analyse des données en temps réel de la progression de la consommation d’oxygène et de l’activité glycolique :

    Paramètres optimisés pour les tests Transcreener TR-FRET

    Tests Transcreener TR-FRET

    Les tests Transcreener® TR-FRET sont des tests immunologiques compétitifs en une étape pour la détection directe des nucléotides avec un affichage du transfert d’énergie de résonance par fluorescence de type Förster en temps résolu dans les infrarouges lointains (TR-FRET). Découvrez comment optimiser les paramètres pour les tests Transcreener TR-FRET sur les lecteurs de microplaques multimode SpectraMax iD5 et i3x.

Ressources sur la fluorescence en temps résolu TRF / TR-FRET (HTRF)

Produits et services connexes