La monoclonalité est un terme décrivant une lignée cellulaire issue d’un progéniteur unique (cellule unique), et qui est donc monoclonale. Le développement de lignées cellulaires et l’assurance de la monoclonalité constituent des étapes essentielles du processus de génération de molécules biopharmaceutiques, telles que les anticorps monoclonaux. Une lignée cellulaire peut être établie après l’isolation d’une cellule viable unique exprimant fortement la protéine d’intérêt. La documentation de preuves de clonalité est l’une des étapes clés de ce processus pour garantir la reproductibilité génétique de la lignée cellulaire.
La preuve de la monoclonalité est un critère réglementaire pour les lignées cellulaires thérapeutiques et est généralement documentée à partir d’images, où une image d’une cellule unique est enregistrée et incluse dans les déclarations réglementaires.
Vérification de monoclonalité : déterminer l’origine d’une colonie. L’historique de croissance (image) de chaque puits peut être retracé jusqu’à son point de départ, ce qui permet de s’assurer de la monoclonalité
Pourquoi la monoclonalité est-elle importante ?
Comme les réglementations relatives au développement de lignées cellulaires sont de plus en plus strictes, vous devrez réaliser un clonage de cellules uniques et fournir des preuves indiquant qu’une lignée cellulaire est dérivée d’une cellule unique (preuve de clonalité). Les méthodes de clonage classiques (p. ex., dilution limitante et FACS [tri cellulaire activé par fluorescence]) utilisent une analyse statistique pour déterminer le degré de fiabilité de la monoclonalité. Toutefois, pour prouver la monoclonalité, il est nécessaire d’avoir des technologies et des méthodologies plus robustes dans le domaine des bioprocédés. De nombreux chercheurs utilisent maintenant systématiquement des systèmes d’imagerie, comme l’imageur CloneSelect Imager, pour vérifier la monoclonalité et surveiller la croissance cellulaire dans les milieux de culture cellulaire. En outre :
Assurance élevée de monoclonalité pour le développement de lignées cellulaires
Le développement de lignées cellulaires qui expriment une protéine spécifique d’intérêt est essentiel à la génération d’agents biologiques, et les organismes de réglementation exigent des preuves de monoclonalité pour accepter la commercialisation d’un agent biologique. L’approche classique implique de visualiser les puits au moyen de lumière blanche émise le jour 0 pour confirmer la présence d’une cellule unique. Toutefois, cette approche n’est pas sans difficulté car les débris cellulaires et les artefacts des puits peuvent facilement être confondus avec des cellules. Par conséquent, les développeurs de lignées cellulaires évaluent généralement les cellules à l’état de colonie et retracent les origines de la colonie pour confirmer la monoclonalité.
La séquence de travail met en avant le processus du système CloneSelect Imager pour vérifier la monoclonalité en se basant sur une analyse objective des images. L’association avec l’instrument CloneSelect Single-Cell Printer pour le tri des cellules uniques améliore la séquence de travail en augmentant le développement clonal et en offrant une assurance supplémentaire de monoclonalité basée sur des images.
Tri de cellules uniques dans des puits de microplaque – Les cellules viables uniques doivent être isolées et clonées afin de garantir que la population de cellules est génétiquement identique, ce qui réduit significativement l’hétérogénéité de l’expression.
Balayage de la plaque WL au Jour 0 et les jours suivants – Analysez par imagerie la plaque au Jour 0 et les jours suivants. La preuve de la monoclonalité (critère réglementaire pour les lignées cellulaires thérapeutiques) est généralement documentée à partir d’images, où une image d’une cellule unique est enregistrée et incluse dans les déclarations réglementaires.
Examen du balayage de la plaque et évaluation du développement global (WL) – Examinez et analysez les images en suivant les taux de croissance cellulaire, les mesures de confluence et la formation des colonies.
Confirmer la monoclonalité et exporter les données des puits pour la présentation réglementaire – Confirmez la monoclonalité et exportez les données des puits dans un rapport détaillé pour la présentation réglementaire.
Améliorer le développement clonal avec un trieur de cellules uniques
L’instrument CloneSelect Single-Cell Printer Series est un système totalement automatisé utilisant une technologie microfluidique exclusive et l’analyse d’images en temps réel pour trier et distribuer des cellules uniques dans des microplaques standard, tout en garantissant simultanément la monoclonalité grâce à la documentation en images. Il permet de pallier aux défauts de la dilution limitante et du tri cellulaire basé sur cytométrie en flux en offrant des preuves de clonalité basées sur des images, un dépôt rapide et efficace des cellules uniques basé sur la lumière blanche (systèmes c. sight et f. sight) ou la fluorescence optionnelle (systèmes f. sight uniquement), une excellente croissance cellulaire post-dépôt, un risque minimal de contamination croisée et un coût de maintenance extrêmement bas. Lorsqu’il est associé à l’imageur CloneSelect Imager, l’instrument Single-Cell Printer series démontre des améliorations de ces deux séquences de travail avec une augmentation du développement clonal et une assurance supplémentaire de monoclonalité basée sur des images.
Technologie CloneSelect Single Cell Printer (A) Après avoir chargé un échantillon contenant des cellules dans une cartouche, cette dernière est montée sur le SCP et une impression peut être lancée. Pendant la procédure d’impression, des gouttelettes sont générées en permanence par un actionneur piézo-électrique d’une manière prévisible. Les gouttelettes qui ne contiennent aucune cellule ou plusieurs cellules sont éliminées à l’aide d’un mécanisme d’aspiration se trouvant directement en dessous de la buse. Lorsque des cellules uniques sont identifiées, un mécanisme d’obturation bloque l’aspiration, ce qui permet de faire tomber la gouttelette contenant une cellule unique dans le puits. (B) Lorsqu’une cellule unique est détectée, cinq images sont capturées afin de fournir des preuves de clonalité à la buse. Les images 1-3 montrent la présence d’une cellule avant l’éjection de la gouttelette, l’image 4 indique la région contenant la cellule unique, et l’image 5 montre la buse après l’éjection de la gouttelette.
Imagerie de microplaques, caractérisation de clones et génération de rapports
(A) Au Jour 10, les clones dérivés de la session d’impression SCP sont analysés par imagerie. L’onglet Plate Thumbnails (Vignettes plaque) permet de visualiser les colonies. Le fait de cliquer sur un puits vous conduit à l’onglet View Image (Visualiser image), où vous découvrez une image du puits entier. (B) L’onglet Loci Count (Nombre loci) permet de compter les colonies à optimiser en ajustant la zone et la compacité, une mesure de rondeur, d’une colonie. (C) Dans l’onglet Generate Report (Générer rapport), les régions cellulaires (encadrés verts) peuvent être désignées et ajustées pour chaque point de capture dans le temps dans une série afin de caractériser le développement d’une cellule unique en colonie.
Ce qui est monoclonal et ce qui ne l’est pas
En utilisant le logiciel CloneSelect Imager pour agrandir des colonies immobilisées individuelles, il est possible de suivre le développement et de déterminer si une colonie est monoclonale en examinant les images de cette colonie à différents points de capture dans le temps. Dans la figure ci-dessous, nous pouvons observer les images de deux colonies. En observant le développement des deux colonies et en suivant les images depuis le Jour 0, il est possible de déterminer si la colonie est ou non issue d’une ou plusieurs cellules. L’ajout de billes (indiquées par les cercles jaunes) au milieu semi-solide sert de référence de localisation pour confirmer que c’est la même colonie qui est analysée par imagerie à chaque fois.
Développement de cellules CHO dans le milieu semi-solide CloneMedia CHO Growth A L’imageur CloneSelect a été utilisé pour capturer des images des plaques à 6 puits à divers points de capture dans le temps. Au Jour 0, on voit clairement une cellule sur la ligne supérieure, tandis qu'il en est observé deux sur la ligne inférieure. Le cercle jaune indique la position d’une bille qui sert de référence de localisation pour confirmer que c’est la même colonie qui est analysée par imagerie dans le temps.
Fournir des preuves visuelles de monoclonalité (rapport)
L’apport de preuves en images de monoclonalité dans le processus de développement de lignées cellulaires ne se résume pas à l’exportation d’une image d’une cellule unique. Par exemple, des images haute résolution de l’intégralité du puits doivent également être inspectées afin de vérifier qu’il n’y a pas une seconde cellule.
En quelques clics, la fonction Monoclonality Report (Rapport monoclonalité) sur l’instrument CloneSelect™ Imager (CSI) organise de façon objective les preuves visuelles à l’appui nécessaires pour établir la clonalité dans un rapport pouvant être facilement partagé, ce qui permet d’économiser les heures normalement employées à faire le même processus manuellement.
Clonalité en toute confiance en utilisant la calcéine AM
Clonalité en toute confiance en utilisant la calcéine AM avec un effet minimal sur la viabilité
Ici, nous démontrons une séquence de travail optimale en utilisant le réactif de fluorescence, la calcéine AM, avec un instrument CloneSelect™ Imager avec capacité de fluorescence qui montre une viabilité similaire à celle obtenue dans des conditions sans marquage, tout en fournissant simultanément une assurance de clonalité élevée.
Clonalité en toute confiance en utilisant la calcéine AM
Clonalité en toute confiance en utilisant la calcéine AM avec un effet minimal sur la viabilité
Ici, nous démontrons une séquence de travail optimale en utilisant le réactif de fluorescence, la calcéine AM, avec un instrument CloneSelect™ Imager avec capacité de fluorescence qui montre une viabilité similaire à celle obtenue dans des conditions sans marquage, tout en fournissant simultanément une assurance de clonalité élevée.
eBook : Optimisez vos lignées cellulaires de grand intérêt
Dans ce livre électronique, nous présentons le flux de travail de développement de lignées cellulaires, ainsi que des solutions haut début pour accélérer le processus et permettre une sélection plus facile et plus rapide des lignées cellulaires de mammifère à productivité élevée.
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Méthode par fluorescence pour identifier les cellules CHO-S monoclonales
Méthodes rapides de vérification de la monoclonalité pour renforcer le développement de lignées cellulaires
Même si la vérification de monoclonalité au moyen de l’imagerie en lumière blanche est possible, avec les débris, la poussière et les bulles d’air, il est difficile et fastidieux d’identifier les cellules uniques, ce qui peut entraîner l’élimination de clones de grand intérêt. Ici, nous présentons une méthode par fluorescence pour l’identification des cellules CHO-S monoclonales en utilisant celltracker green cmdfa.
Méthode par fluorescence pour identifier les cellules CHO-S monoclonales
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Même si la vérification de monoclonalité au moyen de l’imagerie en lumière blanche est possible, avec les débris, la poussière et les bulles d’air, il est difficile et fastidieux d’identifier les cellules uniques, ce qui peut entraîner l’élimination de clones de grand intérêt. Ici, nous présentons une méthode par fluorescence pour l’identification des cellules CHO-S monoclonales en utilisant celltracker green cmdfa.
Assurance élevée de monoclonalité pour le développement de lignées cellulaires
La dilution limitante ou le tri cellulaire activé par fluorescence est généralement exécuté(e) pour ensemencer des cellules uniques dans un puits. La microscopie est ensuite utilisée pour déterminer le nombre de cellules ensemencées dans chaque puits et pour suivre la croissance cellulaire. Même si la vérification de la monoclonalité au moyen de l’imagerie en lumière blanche est possible, avec les débris, la poussière et les bulles d’air, il est difficile et fastidieux d’identifier les cellules uniques, ce qui peut entraîner l’élimination de clones de grand intérêt
Assurance élevée de monoclonalité pour le développement de lignées cellulaires
La dilution limitante ou le tri cellulaire activé par fluorescence est généralement exécuté(e) pour ensemencer des cellules uniques dans un puits. La microscopie est ensuite utilisée pour déterminer le nombre de cellules ensemencées dans chaque puits et pour suivre la croissance cellulaire. Même si la vérification de la monoclonalité au moyen de l’imagerie en lumière blanche est possible, avec les débris, la poussière et les bulles d’air, il est difficile et fastidieux d’identifier les cellules uniques, ce qui peut entraîner l’élimination de clones de grand intérêt
Identification de cellules CHO-S monoclonales cultivées en milieu semi-solide
Identification en toute confiance de cellules cho-s monoclonales cultivées en milieu semi-solide
La culture des cellules CHO dans CloneMedia CHO Growth A constitue une façon plus efficace de cloner des cellules CHO que la réalisation d’une dilution limitante dans un milieu liquide. Le milieu semi-solide immobilise les cellules, ce qui les empêche de se déplacer pendant la manipulation de routine. Cela permet aux chercheurs de suivre en toute confiance la croissance d’une seule cellule dans une colonie.
Identification de cellules CHO-S monoclonales cultivées en milieu semi-solide
Identification en toute confiance de cellules cho-s monoclonales cultivées en milieu semi-solide
La culture des cellules CHO dans CloneMedia CHO Growth A constitue une façon plus efficace de cloner des cellules CHO que la réalisation d’une dilution limitante dans un milieu liquide. Le milieu semi-solide immobilise les cellules, ce qui les empêche de se déplacer pendant la manipulation de routine. Cela permet aux chercheurs de suivre en toute confiance la croissance d’une seule cellule dans une colonie.
Amélioration du rendement du clonage grâce à une assurance de clonalité supérieure
Un flux de travail associant l’isolement des cellules uniques et l’imagerie sur microplaque améliore le rendement du clonage avec une assurance de clonalité supérieure
Un flux de travail optimal permet de faire des économies de temps et de travail et réduit les frais de consommables et de réactifs en augmentant l'efficacité de la croissance tout en fournissant une assurance de clonalité supérieure et des preuves rapides qui sont prêtes à être utilisées et envoyées aux organismes de réglementation.
Amélioration du rendement du clonage grâce à une assurance de clonalité supérieure
Un flux de travail associant l’isolement des cellules uniques et l’imagerie sur microplaque améliore le rendement du clonage avec une assurance de clonalité supérieure
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Fonction Monoclonality report (Rapport monoclonalité) de l’imageur CloneSelect Imager
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Simplification du criblage et de la sélection des lignées cellulaires de mammifères
Utilisation du système ClonePix pour évaluer la monoclonalité
Le système ClonePix System est un outil puissant pour le criblage rapide et l’isolement des lignées cellulaires de mammifères sécrétrices généralement utilisées dans la production de protéines thérapeutiques et d’anticorps monoclonaux destinés à la recherche. Les données présentées dans ce tutoriel étayent l’idée selon laquelle la sélection de colonies de cellules de mammifères à partir d’un milieu semi-solide constitue un moyen efficace d’isoler des lignées cellulaires clonales.
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La série d’imprimantes CloneSelect™ Single-Cell Printer™ dépose des cellules uniques avec précaution et haut rendement grâce à une cartouche jetable à distribution unidirectionnelle, style jet d’encre, brevetée.
L’imprimante CloneSelect™ Single-Cell Printer™ (SCP) de Cytena et Molecular Devices est un système totalement automatisé utilisant une technologie microfluidique exclusive et l’analyse d’images en temps réel…
Le système CloneSelect Imager produit des résultats objectifs, quantitatifs et uniformes plus rapidement, et permet de contourner les difficultés associées aux techniques traditionnelles d'évaluation de confluence des cellules.
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