Monoclonalité
Documenter la monoclonalité : un critère réglementaire pour les lignées cellulaires thérapeutiques.
Qu’est-ce que la monoclonalité ?
La monoclonalité est un terme décrivant une lignée cellulaire issue d’un progéniteur unique (cellule unique), et qui est donc monoclonale. Le développement de lignées cellulaires et l’assurance de la monoclonalité constituent des étapes essentielles du processus de génération de molécules biopharmaceutiques, telles que les anticorps monoclonaux. Une lignée cellulaire peut être établie après l’isolation d’une cellule viable unique exprimant fortement la protéine d’intérêt. La documentation de preuves de clonalité est l’une des étapes clés de ce processus pour garantir la reproductibilité génétique de la lignée cellulaire.
La preuve de la monoclonalité est un critère réglementaire pour les lignées cellulaires thérapeutiques et est généralement documentée à partir d’images, où une image d’une cellule unique est enregistrée et incluse dans les déclarations réglementaires.
Pourquoi la monoclonalité est-elle importante ?
Comme les réglementations relatives au développement de lignées cellulaires sont de plus en plus strictes, vous devrez réaliser un clonage de cellules uniques et fournir des preuves indiquant qu’une lignée cellulaire est dérivée d’une cellule unique (preuve de clonalité). Les méthodes de clonage classiques (p. ex., dilution limitante et FACS [tri cellulaire activé par fluorescence]) utilisent une analyse statistique pour déterminer le degré de fiabilité de la monoclonalité. Toutefois, pour prouver la monoclonalité, il est nécessaire d’avoir des technologies et des méthodologies plus robustes dans le domaine des bioprocédés. De nombreux chercheurs utilisent maintenant systématiquement des systèmes d’imagerie, comme l’imageur CloneSelect Imager, pour vérifier la monoclonalité et surveiller la croissance cellulaire dans les milieux de culture cellulaire.
Assurance élevée de monoclonalité pour le développement de lignées cellulaires
Le développement de lignées cellulaires qui expriment une protéine spécifique d’intérêt est essentiel à la génération d’agents biologiques, et les organismes de réglementation exigent des preuves de monoclonalité pour accepter la commercialisation d’un agent biologique. L’approche classique implique de visualiser les puits au moyen de lumière blanche émise le jour 0 pour confirmer la présence d’une cellule unique. Toutefois, cette approche n’est pas sans difficulté car les débris cellulaires et les artefacts des puits peuvent facilement être confondus avec des cellules. Par conséquent, les développeurs de lignées cellulaires évaluent généralement les cellules à l’état de colonie et retracent les origines de la colonie pour confirmer la monoclonalité.
La séquence de travail met en avant le processus du système CloneSelect Imager pour vérifier la monoclonalité en se basant sur une analyse objective des images. L’association avec le distributeur de cellules uniques DispenCell pour le tri des cellules uniques améliore le flux de travail en augmentant le développement clonal et en offrant une assurance supplémentaire de monoclonalité basée sur des images.
- Triez les cellules uniques dans des puits de microplaque : Les cellules viables uniques doivent être isolées et clonées afin de garantir que la population de cellules est génétiquement identique, ce qui réduit significativement l’hétérogénéité de l’expression.
- Lisez la plaque WL le Jour 0 et les jours suivants : Imagez la plaque le Jour 0 et les jours suivants. La preuve de la monoclonalité (critère réglementaire pour les lignées cellulaires thérapeutiques) est généralement documentée à partir d’images, où une image d’une cellule unique est enregistrée et incluse dans les déclarations réglementaires.
- Examinez la lecture de la plaque et évaluez le développement global (WL) : Examinez et analysez les images en suivant les vitesses de croissance cellulaire, les mesures de confluence et la formation des colonies.
- Confirmez la monoclonalité et exportez les données des puits pour la présentation réglementaire : Confirmez la monoclonalité et exportez les données des puits dans un rapport détaillé pour la présentation réglementaire.
Améliorez le développement clonal avec la distribution de cellules uniques
L’unité de distribution de cellules uniques de DispenCell est équipée d’une pointe de capteur qui détecte le passage des cellules. À mesure que chaque cellule avance, un signal électrique unique se déclenche. Cette trace électrique unique est immédiatement enregistrée, ce qui vous permet de vérifier la preuve de clonalité juste après la distribution des cellules.
La technologie est basée sur l’impédance et est donc extrêmement délicate avec les cellules, préservant leur viabilité et leur intégrité pour un développement optimal. Le DispenCell utilise une pointe de capteur stérile jetable (DispenTip) pour détecter et enregistrer le passage de chaque cellule s’écoulant à travers l’ouverture du DispenTip. Lorsqu’une cellule unique passe à travers l’ouverture pour s’écouler dans le puits, elle laisse une signature électrique sous la forme d’un pic unique, alors que plusieurs pics correspondent à deux ou plusieurs cellules.
Représentation graphique des informations de pic produites par le distributeur dans deux puits à côté de leurs images de CSI FL. L’une avec un pic unique et une seule cellule (en haut) et l’autre avec un double pic et deux cellules (en bas). La cellule unique s’est développée en colonie et son rapport de monoclonalité a été généré à l’aide de la caractéristique de rapport de monoclonalité sur le CSI FL
Ce qui est monoclonal et ce qui ne l’est pas
En utilisant le logiciel CloneSelect Imager pour agrandir des colonies immobilisées individuelles, il est possible de suivre le développement et de déterminer si une colonie est monoclonale en examinant les images de cette colonie à différents points de capture dans le temps. Dans la figure ci-dessous, nous pouvons observer les images de deux colonies. En observant le développement des deux colonies et en suivant les images depuis le Jour 0, il est possible de déterminer si la colonie est ou non issue d’une ou plusieurs cellules. L’ajout de billes (indiquées par les cercles jaunes) au milieu semi-solide sert de référence de localisation pour confirmer que c’est la même colonie qui est analysée par imagerie à chaque fois.
Développement de cellules CHO dans le milieu semi-solide CloneMedia CHO Growth A L’imageur CloneSelect Imager a été utilisé pour prendre des images à partir des microplaques à 6 puits à divers points de capture dans le temps. Au Jour 0, on voit clairement une cellule sur la ligne supérieure, tandis qu'il en est observé deux sur la ligne inférieure. Le cercle jaune indique la position d’une bille qui sert de référence de localisation pour confirmer que c’est la même colonie qui est analysée par imagerie dans le temps.
Fournir des preuves visuelles de monoclonalité (rapport)
L’apport de preuves en images de monoclonalité dans le processus de développement de lignées cellulaires ne se résume pas à l’exportation d’une image d’une cellule unique. Par exemple, des images haute résolution de l’intégralité du puits doivent également être inspectées afin de vérifier qu’il n’y a pas une seconde cellule.
En quelques clics, la fonction Monoclonality Report (Rapport monoclonalité) sur l’instrument CloneSelect™ Imager (CSI) organise de façon objective les preuves visuelles à l’appui nécessaires pour établir la clonalité dans un rapport pouvant être facilement partagé, ce qui permet d’économiser les heures normalement employées à faire le même processus manuellement.
Méthodes d’assurance de la monoclonalité
En savoir plus sur les différentes méthodes permettant de vérifier et de prouver la monoclonalité.