La garantie de monoclonalité est indéniablement essentielle dans le développement des lignées cellulaires pour générer des agents thérapeutiques, tels que des anticorps monoclonaux ou des thérapies cellulaires. Pour utiliser une lignée cellulaire à usage thérapeutique, un chercheur doit prouver que les cellules d’une colonie sont dérivées d’une cellule unique. La simple visualisation des colonies dans des puits de plaques ou l’utilisation d’un niveau de confiance de monoclonalité ne constitue pas une preuve suffisante de monoclonalité s’il n’existe pas de moyen clair de suivre la croissance des colonies à partir d’une cellule unique. Que pouvez-vous faire d’autre pour produire des lignées cellulaires monoclonales et valider leur monoclonalité  ?

Les solutions CloneSelect ^® de Molecular Devices présentent des technologies de flux de travail indispensables au développement de lignées cellulaires monoclonales. Nous avons récemment discuté des défis et opportunités actuels pour améliorer l’ingénierie des lignées cellulaires souches avec Gargi Roy , un chercheur du département du développement biopharmaceutique d’AstraZeneca .

Auparavant, Roy et son équipe de recherche utilisaient le ClonePix ^® FL pour produire des anticorps monoclonaux thérapeutiques à partir de cellules ovariennes de hamster chinois (CHO) [1]. Lorsqu’ils se sont concentrés sur l’ingénierie des cellules souches, il est devenu évident que les deux flux de travail présentaient des différences malgré le fil conducteur commun de la production d’anticorps monoclonaux.

L’équipe de thérapie cellulaire souche d’AstraZeneca utilise nos produits CloneSelect pour l’ingénierie des cellules souches et le développement monoclonal. De plus, Roy a détaillé comment son équipe développe des lignées cellulaires monoclonales avec une plus grande précision grâce aux solutions de criblage de clones de Molecular Devices. Cet article couvre également les éléments suivants  :

Les deux principales approches d’ingénierie des cellules souches sont les suivantes  :

1. Cellules souches pluripotentes induites (iPSC)  : Ils sont convertis à partir de cellules somatiques par l’introduction de facteurs de transcription.
2. Cellules souches embryonnaires (CSE)  : Dérivé de cellules de masse interne embryonnaire non différenciées.

Ce que les deux types de cellules souches ont en commun, c’est que vous pouvez les lever pour produire des anticorps monoclonaux . En outre, les anticorps monoclonaux à médiation cellulaire possèdent certains avantages par rapport aux anticorps monoclonaux recombinants, tels qu’une meilleure pénétration dans la zone malade et un taux de croisement sang-barrière-cerveau (BHE) plus élevé. [2].

Isolation de cellules uniques avec l’imprimante CloneSelect Single-Cell Printer

La première question que l’on peut se poser est  : qu’est-ce qui fait que nos solutions de flux de travail CloneSelect se démarquent dans la fabrication de lignées cellulaires monoclonales et l’évaluation ultérieure de la monoclonalité  ? Imaginez pouvoir déposer simultanément une cellule unique dans un puits et assurer la monoclonalité avec une preuve visuelle au moment du tri.

La série d’imprimantes CloneSelect Single-Cell Printer garantit une isolation homogène des cellules uniques et favorise une excroissance clonale maximale grâce à sa distribution cellulaire douce tout en éliminant la possibilité de contamination croisée avec d’autres lignées cellulaires. Son principe de fonctionnement repose sur sa technologie microfluidique qui encapsule doucement des cellules uniques dans des gouttelettes liquides et les ensemence dans un puits. De plus, il capture cinq images par cellule distribuée, fournissant une preuve basée sur image de l’isolation et du dépôt de cellules uniques au moment du tri.

Pour un système aussi complexe, l’imprimante CloneSelect Single-Cell Printer est facile à utiliser avec notre logiciel exclusif. Une fois que votre laboratoire aura suivi une brève formation avec notre équipe de scientifiques d’application sur le terrain, vous bénéficierez immédiatement de sa conception conviviale et conviviale pour les cellules. Le terme « compatible avec les cellules » fait référence à deux choses  :

1. Absence de lasers à haute énergie (la convivialité des cellules est obtenue grâce à une microfluidique douce alimentée par gravité)
2. Volumes de distribution réduits (pas de déchets et pas de contamination d’un échantillon à l’autre)

Plus important encore, l’acquisition d’images cellulaires de haute qualité par l’imprimante CloneSelect Single-Cell Printer repose sur ses critères d’exclusion basés sur la forme, la taille et le rapport d’axe des cellules. Grâce aux critères d’exclusion, vous pouvez cloner à la fois les cellules parentales et les cellules modifiées avec les propriétés souhaitées.

Comment fabriquer des lignées cellulaires monoclonales  : Le flux de travail général

Que vous travailliez avec des iPSC, des ESC ou de nombreux autres types de cellules, le flux de travail résumé ci-dessous constitue la base de la production de lignées cellulaires monoclonales  :

1. Impression de cellules uniques  : Isoler une cellule unique pour commencer une colonie
2. Expansion et caractérisation cellulaires  : Formez des colonies et évaluez la monoclonalité et assurez-vous que vos cellules expriment les protéines d’intérêt en réalisant des tests génotypiques/phénotypiques
3. Lignées cellulaires clonales  : Différenciation spécifique au type cellulaire

Un flux de travail simple pour commencer avec n’importe quelle population cellulaire, y compris votre cellule parentale, et utilisé pour cloner quelque chose ou une cellule technique pour faire des cellules une propriété souhaitée.

Difficultés liées à l’isolation des cellules uniques et à l’excroissance clonale

Même avec des technologies d’isolation de cellule unique et des flux de travail de monoclonalité de pointe, il est toujours possible de faire face à certains défis.

Selon Gargi Roy, le principal défi est survenu pour son équipe lorsqu’elle souhaitait imprimer des cellules dans plusieurs plaques et former plusieurs colonies avec les mêmes caractéristiques. À mesure que le nombre de répétitions de l’isolation des cellules uniques augmente, on observe souvent une baisse régulière de l’efficacité de l’excroissance clonale. Le déclin est encore plus marqué lorsque vous voulez mettre en œuvre des conditions sans composant animal (ACF), ce que vous devez considérer si la recherche sans animal est essentielle pour votre établissement.

Les divergences dans l’efficacité de l’excroissance clonale sont plus importantes dans les ESC que dans les iPSC. L’efficacité se réduit à un seul chiffre avec des ESC techniques. La principale raison du déclin est la chute de viabilité cellulaire pendant l’ensemencement, déclare Roy. Elle met également l’accent sur l’amélioration de la conception expérimentale en enrichissant le milieu, en particulier dans des conditions d’ACF.

Les différences d’efficacité de l’excroissance des colonies de cellules uniques entre les IPSC et les ESC illustrent des divergences significatives dans les ESC.

Même lorsqu’il y a une excroissance clonale suffisante, vous devez prendre grand soin de prévenir l’apoptose. Une récolte rapide de 8à10 jours est essentielle. Il vous aiderait à nourrir votre colonie chaque jour pour éviter la famine.

L’agrégation des cellules est un autre problème qui entrave l’évaluation de la monoclonalité. Vous devez utiliser le bon réactif de dissociation pour détacher les cellules de la surface du puits et les unes des autres, ce qui est une étape critique pour l’analyse en aval.

Difficultés d’assurance pendant le développement de lignées cellulaires monoclonales

La vérification de la monoclonalité est cruciale pour le développement de lignées cellulaires . Vous devez fournir une preuve détaillée que votre population cellulaire est dérivée d’une cellule unique pour le dépôt réglementaire. L’équipe de Roy a trouvé les ESC particulièrement difficiles à surveiller en raison de leur surface collante et de leurs formes irrégulières. Si deux ESC à proximité immédiate étaient distribuées, elles seraient probablement détectées comme une seule cellule. En outre, si vous êtes confronté à un délai serré, vous pouvez appliquer une dilution limitante pour les statistiques afin de calculer la probabilité de monoclonalité.

L’imprimante CloneSelect Single-Cell Printer est dotée de techniques d’imagerie avancées pour prouver la monoclonalité au moment de l’isolation des cellules uniques. Non seulement l’imprimante peut facilement faire la distinction entre deux cellules très proches pendant le dépôt de cellules, mais elle vous permet également de retracer votre colonie du jour de la récolte au jour 0 pour assurer la monoclonalité comme le montre la figure ci-dessous.

Confirmation de la monoclonalité et capture d’images de cellules uniques avec l’imprimante CloneSelect Single-Cell Printer

Caractérisation clonale

Le dernier composant du développement de lignées cellulaires est la caractérisation. Une fois la monoclonalité évaluée, vous vous assurez que cette monoclonalité se reflète dans le génotype et la pluripotence. Est-ce que les cellules de votre colonie ont toutes des niveaux constants de la fonctionnalité souhaitée  ? Plus important encore, sont-ils génomiquement stables, ce qui signifie qu’ils peuvent conserver et transférer du matériel génétique d’une génération à l’autre  ? Enfin, sont-ils pluripotents (c.-à-d. peuvent-ils se différencier en trois couches germinales principales  : ectoderm, endoderme et mésoderme)  ? Les réponses ne peuvent être obtenues que par criblage de clones haut débit.

C’est là que le CloneSelect Imager peut ajouter de la valeur à vos recherches grâce à une confiance supplémentaire dans l’assurance de monoclonalité. Le CloneSelect Imager contient une technologie en fond clair sans marquage avec imagerie par fluorescence personnalisable, accompagnée d’outils d’analyse de données avancés, notamment des mesures de confluence, des courbes de croissance, la génération de rapports de monoclonalité et des miniatures de plaques pour visualiser rapidement l’excroissance des colonies dans chaque puits.

Grâce à la haute résolution et à la variété des modes d’imagerie, vous pouvez même détecter les marqueurs cellulaires spécifiques aux cellules de votre clone . Cela vous permet de confirmer si vos lignées cellulaires monoclonales ont la fonctionnalité souhaitée.

L’illustration ci-dessous montre la différenciation des CES monoclonales en trois couches germinales distinctes, portant les biomarqueurs respectifs dans chaque couche.

Cellules stables/de haute qualité grâce à notre imprimante à cellule unique, ce qui permet de se différencier facilement en trois couches germinales  : endoderme, mésoderme et ectoderme.

Le champ d’application de l’évaluation fonctionnelle du CloneSelect Imager se poursuit même après le début de l’étape de différenciation cellulaire. Grâce à l’imagerie par fluorescence, vous pouvez surveiller les cellules qui se différencient pour former différentes couches tissulaires.

Comment puis-je en savoir plus sur les lignées cellulaires monoclonales  ?

De la phase initiale de placage à l’excroissance et à la différenciation cellulaire, le développement de lignées cellulaires monoclonales est plus simple grâce à notre flux de travail CloneSelect pour l’assurance monoclonale.

Vous pouvez également explorer les recherches de l’équipe de cellules souches d’AstraZeneca pour plus d’informations sur le flux de travail d’assurance de monoclonalité de l’imprimante CloneSelect Single-Cell Printer et du CloneSelect Imager. Dans le webinaire récent de Molecular Devices, Gargi Roy illustre les défis et les solutions en matière d’assurance de monoclonalité avec les détails de ses recherches qui démontrent comment concevoir des lignées cellulaires monoclonales et évaluer les cellules de votre colonie.

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Rejoignez le webinaire à la demande, Monoclonality Assurance Using CloneSelect Single-Cell Printer et CloneSelect Imager in Human Stem Cell (hSC) Engineering Workflow, avec le Dr Roy .

1. Roy, Gargi, et al. « Le criblage séquentiel par ClonePix FL et la coloration intracellulaire facilitent l’isolation des lignées cellulaires à haut rendement pour la fabrication d’anticorps monoclonaux. » Journal des méthodes immunologiques 451 ( 2017)  : 100-110.Roy, Gargi, et al. « Le criblage séquentiel par ClonePix FL et la coloration intracellulaire facilitent l’isolation des lignées cellulaires à haut rendement pour la fabrication d’anticorps monoclonaux. » Journal des méthodes immunologiques 451 (2017) : 100-110.
2. Frank, Richard T et al. « Examen précis  : cellules souches comme plateforme émergente pour le traitement par anticorps du cancer. » Cellules souches (Dayton, Ohio) vol. 28,11 ( 2010)  : 2084-7. doi :10.1002/stem.513.Frank, Richard T et al. « Examen précis : les cellules souches comme plateforme émergente pour le traitement par anticorps du cancer. » Cellules souches (Dayton, Ohio) vol. 28,11 (2010) : 2084-7. doi :10.1002/stem.513.

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